Name: orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

Bu proje, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı ve İsveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.

1. Klonlama inşa hedef gene/ABDz1-tagged füzyon <ol><li> Ifade plazmid hedef gen (plazmid içeren ABDz1 bir malzeme transferi anlaşması üzerinden serbestçe kullanılabilir) N-terminal ligasyonu için uygun kısıtlama siteleri tarafından çevrili ABDz1 geninin PCR parçaları hazırlayın. </li><li> Cleave saflaştırılmış ifade vektör ve uygun bir reaksiyon tamponu seçilen restriksiyon enzimleri ile PCR parçaları. Ligasyonu önce ürünleri arındırın. </li><li> , Ilgi gen içeren ekspresyon vektörü sınırlı ABDz1 parçası bağlanır ve E. ligasyonu ürün dönüşümü coli (orijinal yöntem RR1ΔM15 zorlanma 8 kullanılmıştır). Seçim için uygun antibiyotikler ile takviye agar plaklarına dönüştürülmüş hücreleri yayılmıştır. </li><li> PCR ekran birkaç koloni ve sıra DNA dizi analizi ile ortaya çıkan ifade kaset doğrulayın. </li><li> Bir gecede bir dizi verif kültürü plazmid hazırlayınIED koloni ve tercih edilen bir ifade suşu (Rosetta insan genleri tarafından kodlanan proteinlerin üretimini artırmak için plazmid bir pRARE barındıran özgün yöntemi E. coli (de3) kullanılmıştır) dönüşüm . </li></ol> 2. Protein ekspresyonu <ol><li> Tek bir bakteri kolonisi, 5 g / l maya özü ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş triptik soy broth 10 ml inoküle edin. ° C gecede 37 150 rpm&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 ml, 100 ml taze orta gecede kültür aşılamak ve hücrelerin logaritmik büyüme fazı ulaştığınızda protein ekspresyonu (lac operonunun kullanılan izopropil-β-D-thiogalactoside başlangıçta 1 mM) neden. </li><li> 150 rpm&#39;de 25 ° C gecelik ve hasat hücreler santrifüj tarafından inkübe edin. </li></ol> 3. Ortogonal yakınlık arıtma <ol><li> 25 ml çalıştıran tamponu (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 (w / v) Tween 20, pH 8.0) pelletini tekrar ve th bozabilir% 60 genlik ve 3 dakika 1.0/1.0 bakliyat sonication e hücreleri. Örnek Santrifüj ve supernatant (0,45 mikron) ve daha ileri saflaştırma önce hedef protein içeren filtre. </li><li> 1 ml / dak &#39;da uygun bir protein arıtma sistemi tampon çalışan 10 sütun hacimleri (CV) ile tedarikçi tavsiyelerine göre daha önce HSA ile birleştiğinde ya da 1 ml HSA sepharose kolon veya NHS aktif sütun, muvazene. 0.5 ml / dak bakteriyel lizat yükleyin ve sonra akış hızı 1 ml / dak sıfırlanır. </li><li> 5 yıkama tampon CV (5 mM NH 4 Ac, pH 5.5) takip çalışan tampon CV ile 5 sütun yıkayın. </li><li> 1 ml / dak elüsyon tamponunda (0.5 M HAC, pH 2.5) ile örnek Zehir ve daha ileri saflaştırma için yıkandı, zirveden kesirler seçmek için 280 nm, monitör emme kesirleri toplamak. </li><li> Yüksek protein konsantrasyonu Havuz kesirler, Sure çalışan tampon iki kez seyreltilmiş (20 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7.2) vepH yaklaşık nötr olduğundan emin olun. Gerekirse pH artırmak için 1 M Tris-HCl, pH 8 ekleyin. </li><li> 0.5 ml / dk, 1 ml / dak Sure çalışan bir tampon 10 CV ile dengelenmiş bir 1 ml HiTrap MabSelect Sure sütun örnek yükleyin. Yükledikten sonra 1 ml / dak akış hızı sıfırlayın. </li><li> Tabii çalışan tampon 5 CV (adım 5) sütun yıkayın ve 0.2 M HAC, pH 2.7 ile proteinlerin Zehir. Hassas hedef proteinlerin eluat toplama üzerine Tris-HCl ilavesi ile doğrudan nötralize edilebilir. </li></ol> Kromatografik adımlar MabSelect eluat tersine çevrilirse Sure sütun tampon (adım 3.1) çalışan seyreltilir ve 1 M Tris-HCl ilave edilerek pH yaklaşık 8 artış olabilir. Emin matris ikinci adımı istihdam Genel olarak, dar doruklarına görülmektedir. 4. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflık Değerlendirme <ol><li> Yük bir saflaştırılmış fraksiyonlarıeğer istenirse, kütle spektrometresi ile analiz arındırılmış ürün molekül ağırlığı, SDS-PAGE azaltılması ve. ABDz1 ücretsiz bir sistein düşürücü olmayan koşullar altında ürün dimerization neden olabilir bu yana tam örnek azaltmak için önemlidir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Ilkesinin bir kanıtı olarak, dik yakınlık arıtma ABDz1 etiketi ile kolaylaştırdı farklı çözünürlük sınıfları, moleküler ağırlık ve izoelektrik noktaları (Tablo 1) temsil eden üç insan hedef proteinlerin değerlendirildi. ABDz1 gen, genetik, hedef genlerin erimiş ve yapıları E. coli ifade edildi, Şekil 2 ardışık yöntemi tüm adımlar için bir akış şeması gösterir. Dik protokolü tarafından arıtma ardından, farklı noktalarda toplanan numuneler, SDS-PAGE (Şekil 3) ile analiz edildi. Sonuçları bir çift etiket ve iki son derece özel bir arıtma adımları yararını açıkça göstermektedir. Makul bir saflık ac olsa bilehieved jeller görüldüğü gibi ilk arıtma adımdan sonra, ardışık adım de son derece zorlu uygulamalar için uygun, çok saf bir ürün elde edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" /> Şekil 1 bispecific ABDz1 etiketi seçimi için kullanılan Kombinatoryal kütüphane tasarımı. 46 amino asit albümin bağlayıcı etki alanı istikrarlı bir üç sarmal paket içine kıvrım ve özellikle ikinci sarmal bulunan insan serum albümin için bağlayıcı bir site içerir. Genetik on birinci ve üçüncü sarmal bulunan yüzey maruz kalan amino asitler rastgele olarak, yeni bir bağlayıcı yüzey mühendisliği oldu. Onbir pozisyonları rakam gösterilir ve Kraulis ve ark göre numaralandırılmıştır. [9 ]. Faj üzerinde ifade Kombinatoryal kütüphanesi ile, bispecific ABDz1 molekül tespit edildi Stafilokokal protein Z etki alanı bir dimer karşı biopanning ardından. <img alt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. dik benzeşme arıtma protokolü için basitleştirilmiş akış şeması. ABDz1 dizisi içeren bir PCR-parçası, uygun bir ifade vektör ilgi bir gen ile (N-terminal) bağlandı. Ligasyonu ürün E. dönüştürülmüştür. sıra doğrulama ve plazmid hazırlık için coli. Bir ifadesi ev sahibi dönüşümün ardından, rekombinant protein ekspresyonu için büyük ölçekli bir kültür, bir ilk gecede kültür kurulur. Bakteriler santrifüj yoluyla, hedef protein içeren bakteriyel lizat üretmek için hasat ve sonication tarafından parçalanmış. Artık katı parçacıklar kaldırmak için bir filtrasyon adımdan sonra art arda iki arıtma adımları geçiren lizat bir sıvı taşıma sistemi dik yakınlık arıtma tabi tutulur. Yıkandı, hem de arıtma adımları doruklarına örneklenmiş ve saflık değerlendirmek için SDS-PAGE tarafından değerlendirilir ve t karşılaştırıldığındao arıtma önce lizat. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" /> Şekil 3. füzyon ifade ABDz1 ile saflaştırılmış hedef proteinleri SDS-PAGE analizi. Sure-sütun MabSelect tarafından izlenen bir HSA-sütun üzerinde arıtma karşılık gelen doruklarına örnekler, farklı özellikler gösteren ABDz1, ABDz1 Etiketin kendisi için füzyon ifade üç proteinlerin bakteriyel lizat alınan numuneler ile bir araya toplanmıştır (A) . Lanes 1-4 9-12 MabSelect Sure arıtma (ikinci adım) arıtma, HSA arıtma şerit 5-8 (ilk adım) ve şerit önce lizatları örnekler temsil eder. ABDz1-141.377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ve ABDz1: Örnekler aşağıdaki sırayla yüklenir. (B) yanı sıra, aynı sütun üzerinde tersten saflaştırılmış aynı lizatları elde örnekleri incelendi. Lanes arıtma, şerit 4-6 f önce lizatları örnekleri temsil 1-3rom MabSelect emin arıtma (ilk adım) ve HSA arıtma (ikinci adım) şerit 7-9. Örnekleri (A), ancak etiket kendisi dahil değildir olarak aynı sırayla yüklendi. Bu sonuçlardan yola çıkarak bu iki adımlı bir yöntem adımları sırayla uygulanır bakılmaksızın yüksek derecede saflaştırılmış protein verir açıktır. <table border="1"><tbody><tr><td> Adı b </td><td> Hedef protein Uniprot c </td><td> Moleküler ağırlık (kDa) </td><td> Çözünürlük sınıf d </td><td> Molekül ağırlığı füzyon ürünü (kDa) </td><td> Izoelektrik nokta füzyon ürün </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8,5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4,9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8,9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6,8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Yalnız ABDz1 etiketi Molekül ağırlığı 6.3 kDa, izoelektrik noktası 6.7. </li><li> Hedef protein, Uniprot protein bir kısmını temsil eder. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> N-terminal protein parçası Onun 6 ABP 10 Çözünürlüğü sınıfı. </li></ol> Tablo 1. ABDz1 etiketi ile hedef proteinler ve füzyon ürünleri bir ilke çalışmanın bir kanıtı olarak değerlendirilir. Üç farklı molekül ağırlığı, çözünürlük ve izoelektrik noktası eşsiz insan proteinleri dik benzeşme yaklaşımı ile ifade ve saflaştırılması için seçilmiştir.

<ol>
	<li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+most+of+affinity+tags.">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification.">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li><li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin.">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li><li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein.">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li><li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification.">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+affinity+domains+for+the+detection,+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins.">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li><li>R&#252;ther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts.">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li><li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle:+a+heteronuclear+NMR+study.">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein.">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li><li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins.">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery.">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery.">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan dik benzeşme arıtma protokolü hedef proteinlerin geniş bir yelpazede etkili arınma sağlar. Bağlayıcı bir roman yüzeyi ile albümin bağlayıcı etki doğasında bağlayıcı site birleştirerek, küçük bir bispecific protein etiketi geliştirilmiştir. Bu, sadece herhangi bir tercih ifade vektör ilgi herhangi bir protein klonlanmış ve füzyon ifade beri etiket kullanmak için çok basittir. Çoğu laboratuvarlarda kullanılabilir Standart donanım, iki adımlı bir protein saflaştırılması için istihdam edilebilir. ABDz1 etiketi etki alanı verimli bir şekilde iki bağlayıcı yüzeyler ortaya çıkarmak için doğru katlama fonksiyonu bağlı olduğundan, bu yöntem çözünür şeklinde ifade proteinler sınırlı ve denatüre koşulları altında saflaştırılması için uygun değildir. Indirgeyici ajanlar, MabSelect emin bir matris üzerine Z-etki alanına ABDz1 bağlama ile müdahale yılından bu yana da kaçınılmalıdır. Ortogonal afinite purificaTION birçok zorlu uygulamalar proteinlerin yüksek oranda saflaştırılmış gereksinimlerini karşılamak için geleneksel yöntemlere bir alternatif sağlar. Bu yöntem aynı zamanda, farklı saflaştırma stratejileri arkaya kullanılan Kombinatoryal etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Yerli bir hedef protein gerektiren uygulamalar için, mümkün ABDz1 etiketi 11 enzimatik kaldırılmasını işlemek için proteaz bölünme sitesi tanıtıldı olabilir. Ayrıca, bugüne kadar açıklanan ilk bispecific küçük ve katlanmış protein etki alanı ABDz1 etiketi. Iki hedef özel yakınlık etkileşimleri bağlıdır arıtma stratejisi sağlar çünkü benzersizdir. Geleceğe hazır ve ucuz kromatografik reçine ile uyumlu olan yeni bağlayıcı yüzeyler taşıyan roman bispecific etiketleri gelişmekte olan bu konsepti genişletmek için ilginç olacaktır. Örneğin, temel kalıntıları, bir etiketi i ile uyumlu amino asitler albümin bağlayıcı bir yer değiştirerekdeğiştirici kromatografi ulaşılabilir olabilir. Benzer bir kavram, sırasıyla, Z asit 12 ve Z temel 13 anyon ve katyon değişim ile uyumlu olarak bilinen etiketleri oluşturmak için Z-etki sorumlu mühendislik etkili olduğu kanıtlanmıştır .

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> Rosetta E. coli (de3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> Triptik soy broth </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> Maya özü </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Titreşim hücre sonikatör </td><td> Sonics ve malzeme </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA sepharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Eski ürün </td></tr><tr><td> Tabii HiTrap MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS aktive HP sütun </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag

Protokolleri rasyonalize gerekir rekombinant proteinlerin saflaştırılması ile ilgili yüksek maliyetler nedeniyle. Yüksek verimli çalışmalar için hedef protein özel optimizasyon 1 gerekmez genel yöntemler için bir talep vardır. Bunu başarmak için, genetik ilgi gen erimiş olabilir arıtma etiketleri genellikle 2 kullanılır. En yaygın olarak kullanılan bir yakınlık kolu hexa-histidin etiketi, yerli ve denatüre edici koşullar 3 hem de altında arıtma için uygundur . Etiketiyle üretimi için metabolik yükünün düşük, ama rakip afinite kromatografisi dayalı stratejiler 1,2 gibi yüksek bir özgüllük olarak sağlamaz . Burada, 46 amino asit iki farklı bağlanma yerleri ile bispecific arıtma etiketi, küçük protein etki alanı olmuştur. Albümin bağlayıcı etki alanı Streptokoksik protein G türetilmiştir ve insan serum albümin güçlü bir doğal yakınlığına sahiptir.Kalkış Desteği (HSA). Onbir yüzey maruz albümin bağlayıcı 4 ilgisi olmayan amino asitler, kombinatoryal bir kütüphane üretmek için genetik olarak randomize edildi . Rastgele bağlayıcı yüzey (Şekil 1) düzenlenen romanı ile protein kütüphane faj ekran teknolojisi bağlayıcı seçimi kolaylaştırmak için faj partikülleri ifade edildi. Dimerik karşı biopanning birkaç tur sayesinde Z Stafilokokal protein A 5, HSA ve roman hedef 6 tespit edildi hem yakınlığa sahip küçük bir bispecific molekül türetilmiş etki alanı. ABDz1 olarak anılacaktır roman protein etki, farklı molekül ağırlığı, çözünürlük ve izoelektrik nokta ile hedef proteinlerin bir seçim için bir arınma etiketi olarak değerlendirildi. Üç hedef proteinlere Escherishia coli K-Termini erimiş ve daha sonra afinite saflaştırılmış roman etiketiyle ifade edildi. Immobilize HSA veya Z-etki alanı ya da bir sütun ilk arıtma ilişkiler sonuçlandıvely saf ürünler. Bispecific etiketi ile iki adım yakınlık arıtma protein saflık önemli bir iyileşme sonuçlandı. Kromatografik Z-alanıyla medya, Sure örnek MabSelect, immobilize antikor saflaştırılması için hazır ve HSA kolayca kimyasal ikinci matris sağlamak için medya birleştiğinde olabilir. Kurtarılan hedef proteinin saflığı yüksek bir talep olduğunda bu yöntem özellikle avantajlıdır. Ifade ev sahibi metabolik yük etiketiyle küçük boyutu nedeniyle sınırlı iken etiketi bifunctionality iki farklı kromatografik adımları kullanılmasına izin verir. Birden fazla etiket kombinasyonu 1,7 kullanılır Kombinatoryal etiketleme denilen rekabetçi bir alternatif sunuyor.

Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Yeni ve son derece verimli, iki kademeli afinite kromatografisi protokolü geliştirildi ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yöntem iki içsel yakınlık küçük bir arıtma etiketi dayanan ve farklı özelliklere sahip geniş bir hedef proteinlerin uygulanabilir.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...