Name: solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Byoung-Chul Lee, Philip Choi og Samuel Ho for værdifuld hjælp. Dette arbejde blev udført på Molekylær Foundry på Lawrence Berkeley National Laboratory, som støttes af Kontoret for Videnskab, Office of Basic Energy Sciences, af det amerikanske Department of Energy under Kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231 og Defense Threat Reduction agenturet i henhold til Kontrakt nr.: IACRO-B0845281.

1. Solid-Phase Submonomer Syntese af Polypeptoids Fast-fase syntese (SPS) er en almindelig teknik, der anvendes til at syntetisere sekvens-specifikke biopolymerer trinvist, direkte på et inert fast støtte såsom et polymert harpiks perle. Høj kobling udbytter og nem overskydende reaktant fjernelse er store fordele ved SPS. Efter en kobling reaktion på den harpiks, der er overskydende reagenser simpelthen drænet, og perlerne er vasket for at være klar til næste reaktionstrin. Efter den endelige syntese reaktion, er de i fuld længde oligomerer spaltes fra harpiks og løsningen-fasen materiale kan blive yderligere undersøgt. Her tilpasser vi SPS procedure til at generere sekvens-specifikke peptoid polymerer. <ol><li> Opsætning: Alle trin af den manuelle peptoid syntese kan udføres i en engangs, polypropylen (PP) fritted patron eller en fritted glas reaktion fartøj er udstyret med en 3-vejs stophane. Udfør alle operationer i et stinkskab. For inkubationer i Glass fartøj eller plast patron, skal du tilslutte den ene arm til en kvælstoftilførslen til forsigtigt at boble løsningen for korrekt blanding. Alternativt, for reaktion inkubationer i den disponible patronen, sæl begge ender af patronen med hætter og sted på en roterende shaker. Til afløb reaktion blandinger eller vasker, oprette forbindelse til hus vakuum via en vandlås. Skibet skal være fritted med en grov fritte. Siliconize glasset reaktion fartøj for at undgå perler klistrer til væggene i glasbeholder. Forbered en opløsning af 5% dichlorodimethylsilane i dichlorethan (v / v). Fyld en ren og tør reaktion fartøj til toppen med siliconizing løsning, lad sidde i 30 minutter, så afløb. Skyl glasset gang med DCE og derefter en gang med methanol. Den siliconizing Løsningen kan genbruges, så det skal gemmes. Enten lufttørre eller ryste eventuel overskydende opløsning og bager glasvarer, indtil tørre efter fjernelse af stophane. Cool reaktion fartøj, før du tilføjer harpiks. </li><li> Tilsættes 100 mg (0,06 mmol) Rink amid resynd til et fritted reaktion fartøj. Swell harpiksen ved at tilsætte 2 ml dimethylformamid (DMF). Indholdet blandes ved at ryste eller gennemstrømning i 10 minutter. Tøm løsning ved vakuum at isolere den svulmede harpiks. </li><li> Tilsæt 1 mL 20% 4-methylpiperidine i DMF (v / v) til deprotect de Fmoc gruppen. Ryst i 2 minutter og afløb. Gentag med en 12 minutters inkubation. </li><li> Skyl harpiksen ved at tilsætte 2 ml af DMF, agiterer for 15 sekunder, og dræning. Gentag 3x. </li><li> Bromoacetylation: Tilsæt 1 ml af 0,6 M bromoacetic syre (0,6 mmol) i DMF og 86 μL af N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (0,93 ækvivalent, 0,56 mmol). Inkuber med blide bobler i 30 minutter, derefter afløb og skylles med 2 ml DMF (gentag 4x). </li><li> Deplacement: Tilsæt 1 mL 1-2 m amin i N-methylpyrrolidinone. Inkuber med boblende for 30-120 minutter, derefter afløb og skyl med DMF (4x 2 ml). </li><li> Fortsæt med at dyrke peptoid kæde ved at gentage de submonomer cyklus, trin 1,5 (bromoacetylation) og 1,6 (displacement). </li></ol><ol start="8"><li> Efter den sidste forskydning sker, skylles med 2 ml DMF (gentag 4x), derefter 2 ml dichlormethan (gentag 3x). Cap og gem reaktionen fartøjet, indtil fartøjet kavalergang. </li><li> Pause i syntese (valgfrit): Hvis du vil holde pause i løbet af en peptoid syntese, slut forskydningen reaktion og fortsæt til trin 1.8. For at fortsætte med at dyrke peptoid kæden, skal du genstarte syntese af re-hævelse de tørrede resin (trin 1,2) og gentage submonomer cyklus (trin 1,5 og 1,6). Harpiksen kan tørres og opbevares efter en flytning, undtagen 2. forskydning, fordi de harpiks-peptoid konjugat kan danne en cyklisk diketopiperazine side produkt. </li><li> For flere samtidige synteser, er en fast-fase ekstraktion vakuummanifolden anbefales at maksimere effektiviteten. Peptoid syntese kan også automatiseres ved korrekt programmering metoder i kommercielt tilgængelige peptid synthesizere, såsom Aapptec Apex 396 af CEM Liberty mikroovn synthesizer og Protein Technonologier Inc. Prelude synthesizer. </li></ol> 2. Spaltning og Side-Chain Deprotection <ol><li> Overdrage alle tørret harpiks til en 20 mL scintillationen hætteglas. </li><li> Arbejde inde i en hætte og anvender de rette personlige værnemidler, tilsættes 4 mL trifluoreddikesyre (TFA) kavalergang cocktail 1 (f.eks 95% AQ. TFA, se diskussionen) til scintillation hætteglas og låg. Ryst i 10 minutter til 2 timer ved stuetemperatur (se diskussionen). </li><li> Saml TFA kavalergang løsning ved at filtrere harpiks gennem en engangsemballage, PP fritted cylinderampullen op i en ny, tarerede 20 ml scintillationen hætteglas. En engangs, PP pipette er bekvemt at overføre kavalergang cocktail løsninger. </li><li> Tilsæt 1 ml frisk spaltning cocktail til at skylle harpiks og indsamle eventuelle rester peptoid. Gentag 2x. </li><li> Inddampes TFA ved at blæse en svag strøm af nitrogen eller ved hjælp af en Biotage V10 fordamper. </li><li> Genopløses råolien i 6 mlacetonitril / vand 1:1 (v / v) til HPLC. Frys og lyophilize. Gentag. </li><li> Man noterer vægten af ​​den rå vare. Store som en pulverslukker ved -20 ° C </li><li> Test spaltning (valgfrit): En test kavalergang på 0,5% af harpiksen kan udføres hurtigt at fastlægge renhed og massen af ​​den syntetiserede peptoid og om korrekt kavalergang betingelser var valgt. Test skel er især nyttige til at overvåge udviklingen i syntese. </li></ol> 3. Karakterisering og rensning af Polypeptoid <ol><li> Gennem en kombination af analytisk HPLC, electrospray LC-MS og / eller MALDI-TOF, bestemme renheden af ​​råolie produktet, og om den ønskede molekylvægt er til stede. </li><li> Forbered en ~ 5-10 mg / ml opløsning af den tørre peptoid pulver i vand med minimale acetonitril som er nødvendig for opløselighed. Filter klar opløsning af rå peptoid produkt med 0,45 μm sprøjte filter til at fjerne støv og partikler. </li><li> Analytisk HPLC og electrospray LC-MS: Forbered en ~ 20 mg / ml rå peptoid løsning. Filter 200 μL med et 0,45 μm filter og injicere 20 μL. </li><li> MALDI: Bland 1 ml af ~ 20 mg / ml peptoid med 1 ml matrix. Spot 1 ml på MALDI pladen og lad det lufttørre. Matrix og erhvervelse tilstand er afhængig af prøve (Fig. 5). </li><li> Rense rå peptoid blanding med omvendt fase prep HPLC. Vælg den gradient og kolonne (C4 og C18) baseret på hydrofobicitet af polypeptoid. Kombiner rensede fraktioner, fryse, og lyophilize, hvilket resulterer i et luftigt hvidt pulver. Man noterer vægten af ​​det færdige produkt. </li><li> Dannelse af HCl-salt (valgfri): genopløses det frysetørrede pulver i 100 mM HCl (Aq.) med minimal acetonitril. Overførsel til et tareret hætteglas. Freeze og re-lyophilize. Gentag 2x. Vejes for at bestemme massen af ​​peptoid pulver. </li></ol> 4. Peptoid Nanosheet Dannelse Dette afsnit describes protokollen til at danne ark fra en enkelt-kæde, sekvens specifik, amfifile 36-mer peptoid (fig. 1). Efter peptoid Strand er syntetiseret, renset, og frysetørret som beskrevet ovenfor, er den resulterende hvidt pulver opløst i DMSO at lave en 2 mm stamopløsning. <ol><li> Forbered 500 μL af 20 μM peptoid løsning i ark dannelsen buffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 i vand) i en 1 dram hætteglas. Tilføj først 445 μL af Milli-Q vand, 50 μL på 10x ark dannelse buffer, og vortex for at blande. Derefter tilsættes 5 mikroliter af 2 mM peptoid stamopløsning og forsigtigt hvirvel løsning. Cap i hætteglas. </li><li> Ark er dannet ved forsigtig omrystning af den fortyndede vandige peptoid løsning. Langsomt vippe hætteglas fra vandret position til opretstående stilling resultater i ark. Skånsom ryster giver også plader, men pladerne tendens til at være mindre og med færre lige kanter. En mere grundig analyse af arket dannelsen mekanisme er reported separat. 2 </li><li> For mange af høj kvalitet ark, rotere hætteglas om den vandrette akse langsomt (&lt;1 RPM) i en til tre dage. En passende tekniske ressourcer RKVSD Rotamix rør rotator eller et skræddersyet rocker kan udføre denne kontinuerligt. </li><li> Dialyse af Nanosheets (valgfrit): I visse applikationer kan det være nødvendigt at fjerne enhver frit peptoid kæder eller buffere / salte. Soak et Float-a-Lyzer 100 kD membran i den ønskede buffer i 15 minutter. Load 500 μL peptoid ark opløsning i prøven kammeret. Soak i 500 ml af ønskede buffer, omrøring med en magnetisk opsigt bar ved 60 rpm. Tillad dialyse af plader at gå videre i 4 timer. Hver time, udveksling med en frisk bestand af stoedpudeoploesning. </li></ol> 5. Fluorescensmikroskopi af Nanosheets <ol><li> Fluorescens billeder af nanosheets blev filmede med Nile Red, en miljøvenlig farve, hvis fluorescensintensitet øges, når den er lokaliseret i hydrophobic miljøer (fig. 2). </li><li> Tilsæt 1 ml af 100 mM Nile Red til 100 μL af nanosheet løsning for at opnå en endelig koncentration på 1 μM af Nile Red. </li><li> Lav en 1% agarose opløsning i varmt vand og hældes i en plastik petriskål. Sørg for agarose opløsning er ca 1 / 8 tomme tyk og lad opløsningen køle uforstyrret på en flad overflade. Efter agarose sæt, bruge en spatel til at klippe og forflyttelse 1 cm x 1 cm firkanter til en glasplade. </li><li> At indsamle arkene i samme plan, spot 1 ml af ark løsning på det stykke af agarose. Lad agarose til at absorbere den buffer i 2 minutter og efterlod arkene på overfladen. Billede inden for 15 minutter, ellers agarose vil begynde at deformere på grund af dehydrering. </li><li> Til billede ark i opløsning, 15 μL belastning inde i en 20 mm diameter på 0,12 mm pakning på et objektglas. Dæk med et dækglas. Hvis arkene simpelthen er klemt inde mellem et objektglas og dækglas uden pakning, mange ark will forskydning og den tilsyneladende mindre fordampning vil få plader til konstant at flytte. </li><li> Billede ark under epifluorescence belysning (fx et Olympus IX81 inverteret mikroskop udstyret med en Andor iXonEM + EMCCD spektre med et Texas rødt filter). </li></ol> 6. Scanning Electron Microscopy (SEM) af Nanosheets <ol><li> Plasma etch af silikone substrat (valgfrit): De silicium-chips er plasma ætset for at støtte i adsorption af plader. Placer silicium chips i vakuum kammer i et plasma renere (f.eks harrick Plasma Cleaner / Sterilizer PDC-32G). Pump ned til 200 mTorr og sæt RF spole til 18W (høj indstillingen for PDC-32G). Etch i 2 minutter. </li><li> Drop 20 μL af peptoid ark løsning på et plasma-behandlet silicium substrat. Lad det sidde i 3 minutter. Fjern overskydende opløsning med spidsen af ​​Kim-tørre. Pipetter 20 μL vand på overfladen og fjerne overskydende opløsning igen for at fjerne buffer og salte. Gentag 4x. </li><li> Alternativt kan du ringeyze de peptoid arket løsninger mod vand for at fjerne buffer og salt. Drop 20 μL af dialysebehandling ark løsning på plasma-behandlede silicium substrater. Lufttørre prøven. </li><li> Billede ark med SEM (f.eks Zeiss Gemini Ultra-55 Analytisk Scanning Electron Microscope) med en in-linse detektor og ved stråle energier mellem 1 kV og 5 kV (Fig. 3). </li></ol> 7. Sikkerhed Bemærkninger: <ol><li> Dimethylformamid og Dichlormethan er rimelig mistanke om kræftfremkaldende stoffer. </li><li> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine og bromoacetic syre er skadelige for hud, øjne og luftveje. De bør bruges i hætte med omhu. Det kan være giftige, hvis de indåndes eller optages gennem huden, og eksponering kan resultere i sensibilisering. Tomme beholdere fastholder produktrester (væske / damp) og skal skylles grundigt, før du fjerner dem fra emhætten. </li><li> TFA er en stærk syre, og er ekstremt ødelæggende for de øvre luftveje, øjne oghud. TFA er også flygtig holde koncentrerede opløsninger af TFA i hætten på alle tidspunkter for at undgå respiratoriske skader. Brug korrekt PPE, og forsigtighed ved håndtering af løsninger i TFA. Skift handsker straks, hvis de kommer i kontakt med TFA, og straks at rense eventuelle spild. </li></ol> 8. Repræsentative resultater: Dette afsnit beskriver den syntese, karakterisering og oprensning af en sekvens-specifik 36-Mer peptoid kæde, der foldes til en meget bestilt nanosheet 3 (fig. 1). Blokken-charge peptoid H-[Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 blev syntetiseret på 100 mg Rink amid harpiks. A 2 M amin løsning blev brugt til alle forskydning reaktioner, som blev udført i 60 minutter for restkoncentrationer 1-18 og 120 minutter for rester 19-36. t-Butyl beta-alanin HCl blev konverteret til den frie base (se diskussionen), mens phenethylamine og BOC-ethylendiamin blev både brugt directly. Harpiksen blev kløvet med 95% TFA, 2,5% triispropylsilane, 2,5% vand i 2 timer. TFA var fordampet, og den resulterende tyktflydende olie (~ 180 mg) blev genopløses i 6 ml acetonitril: vand 1:1 (v / v). Produkt renhed (fig. 4) og tilstedeværelse af produktet masse blev bekræftet af fra analytiske RP-HPLC (30-80% acetonitril i vand gradient, både indeholder 0,1% (v / v) TFA, ved 1 ml / min over 30 minutter ved 60 ° C med en C18, 5 m, 50 x 2 mm spalte) og MALDI (Fig. 5). Rensning med omvendt fase HPLC på en Vydac C18 kolonne (10 ìm, 22 mm x 250 mm) skred frem, med en hældning på 30-60% acetonitril i vand med 0,1% TFA over 60 minutter ved 10 ml / min. Kolonnen var lastet med 60 mg af råolie produkt for Hver kromatografisk serie. Den rensede fraktioner blev kombineret baseret på renhed fra analytiske RP-HPLC (Fig. 4) og frysetørret at give ~ 80 mg af et luftigt hvidt pulver. Renset blok-charge peptoid molekylærevægt blev bekræftet af MALDI. 1 ml af 100 mM renset peptoid i acetonitril: vand 1:1 (v / v) blev blandet med 1 ml af matrix (5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic syre i acetonitril: vand 1:01 v / v og 0,1% TFA) og 1 ml blev spottet på MALDI plade. Efter prøven lufttørret, blev det placeret i Applied Biosystem / MDS Sciex 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer. Købet og behandling modes var lineær lav masse. Den beregnede vægt blev indført i målrettet massen til automatisk at justere for forsinkelsen tid. Laseren intensitet blev sat til 3400. Den observerede masse, 4981,2, svarer nøje til den beregnede masse 4981,74. Det frysetørrede renset Pulveret blev opløst i DMSO at lave en 2 mm stamopløsning, som kan opbevares ved 4 ° C. Ark blev udarbejdet af førnævnte protokol og filmede med fluorescens optisk mikroskopi og SEM (fig. 2 og 3). En række forskellige former med funktionen størrelser op til 300 μm overholdes, og notably, lige kanter er fremtrædende. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" /> Figur 1 Sekvens af blok-charge peptoid H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. En enkelt-kæde, blok afgift, amfifile polypeptoid 36-Mer selv samler ind højt bestilt, to-dimensionelle nanosheets 3. Den beregnede molvægt 4981,74. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" /> Figur 2. Fluorescens mikroskopi billeder af peptoid nanosheets. Ark blev dannet af en 20 μM peptoid opløsning i 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Pladerne blev afbildet på agarose med 1μM Nile Red. Scale barer er 100 mM. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" /> Figur 3. Scanning elektronmikroskopi billederaf peptoid nanosheets. Ark blev dannet af en 20 μM peptoid opløsning i 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Scale barer er 5 m. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" /> Figur 4 Analytisk omvendt fase HPLC spor af H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Den rå og renset analytisk HPLC trace (30-80% gradient ved 1 ml / min over 30 minutter ved 60 ° C med en C18, 5 m, 50 x 2 mm spalte) af rå og renset blok-charge peptoid H-[ Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 er vist. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" /> Figur 5 MALDI-TOF masse spektroskopi spor af H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Den observerede masse, 4981,2, er i tæt aftale til den beregnede masse, 4981,74.

<ol>
	<li>King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cleavage+method+which+minimizes+side+reactions+following+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis.">A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).</li><li>Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaken,+not+stirred:+Collapsing+a+peptoid+monolayer+to+produce+free-floating,+stable+nanosheets.">Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets.</a> J. Am. Chem. Soc. , (2011).</li><li>Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+single-chain,+information-rich+polypeptoid+sequence+into+a+highly-ordered+nanosheet.">Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet.</a> Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+multistep+synthesis+of+a+bioactive+peptidomimetic+oligomer+for+the+undergraduate+laboratory.">Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory.</a> J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).</li><li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+peptoids:+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function.">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).</li><li>Zuckermann, R. N., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+as+potential+therapeutics.">Peptoids as potential therapeutics.</a> Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).</li><li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+that+mimic+the+structure,+function+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides.">Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> , 105-2794 (2008).</li><li>Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+method+for+detection+of+amyloidogenic+misfolded+proteins.">A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins.</a> Biochem. 50, 4322-4329 (2011).</li><li>Huang, C. -. Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipitoids+-+novel+cationic+lipids+for+cellular+delivery+of+plasmid+DNA+in+vitro.">Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro.</a> Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).</li><li>Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Br&#228;se, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoidic+amino-+and+guanidinium-carrier+systems:+Targeted+drug+delivery+into+the+cell+cytosol+or+the+nucleus.">Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li><li>Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+a+biomimetic+diblock+copolypeptoid+into+homochiral+super+helices.">Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).</li><li>Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+ultra-thin+two-dimensional+crystals+from+sequence-specific+peptoid+polymers.">Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers.</a> Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+synthesis+of+artificial+proteins:+The+Discovery+of+an+amphiphilic+helical+peptoid+assembly.">Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly.</a> Chemistry &#38; Biology. 9, 647-654 (2002).</li><li>Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combinatorial+approach+to+the+discovery+of+efficient+cationic+peptoid+reagents+for+gene+delivery.">A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).</li><li>Mora, P. u. i. g., Masip, I. s. a. b. e. l., Cort&#233;s, N. u. r. i. a., Marquina, R. e. g. i. n. a., Merino, R. a. m. &. #. 2. 4. 3. ;. n., Merino, J. e. s. &. #. 2. 5. 0. ;. s., Carbonell, T. e. r. e. s. a., Mingarro, I. s. m. a. e. l., Messeguer, A. n. g. e. l., P&#233;rez-Pay&#225;, E. n. r. i. q. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+from+a+positional+scanning+peptoid+library+of+in+vivo+active+compounds+that+neutralize+bacterial+endotoxins.">Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins.</a> J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).</li><li>Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+(N-substituted)glycine+peptoid+Library.">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li><li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library.">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-(substituted)glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+(&amp;alpha;+peptoids)+and+derivatives.">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&amp;alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis.">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Applikationer og betydning Denne protokol beskriver en enkel og effektiv metode til peptoid syntese og den vandige selvsamling af peptoids ind nanosheets. De fleste laboratorier er let i stand til syntese peptoids fordi billige materialer, grundlæggende ekspertise og ligetil teknikker udnyttes 4. Ligeledes selvsamling af ultra-tynde, højt bestilt nanosheets kræver blot gentaget vippe et hætteglas med en fortyndet vandig peptoid opløsning 2. Peptoids er lovende materialer til biomedicinske og nanoscience forskning, fordi de er robuste og syntetisk fleksible endnu sekvens-specifikke og meget afstemmelige 5. Peptoids har vist biologisk aktivitet (lægemidler 6,7, diagnostik 8, intracellulær levering 9-10) og foldning i hierarkiske nanostrukturer 3, 11-14. På grund af deres modulære syntese, kombinatorisk peptoid librVædderen 15-19 let kan syntetiseres og screenet for en lang række aktiviteter eller egenskaber. Især tjene nanosheets som en potentiel platform for to-dimensionelle display stilladser, membran mimetika, biologiske sensorer, protein mimetika og enhed fabrikation. Med de næsten uudtømmelig forskellige sekvenser muligt, er den rige peptoid forskning hurtigt ekspanderende. Variabler i fast-fase submonomer syntese af polypeptoids På grund af evnen til at vælge fra en utrolig stor og forskelligartet alfabet af monomerer 20, har behov for submonomer metode lejlighedsvise ændringer i de tilfælde, hvor et stigende koblingen effektiviteten af hvert trin vil forbedre det samlede produkt udbytte. Indarbejdelse af ubeskyttede heterocykliske sidekæder kræver brug af chloroacetic syre i stedet for bromoacetic syre 21. Udvidet fordrivelse gange og højereamin koncentrationer er normalt ansat efter ca 20 koblinger til lange peptoid sekvenser eller mindre nukleofile aminer. Opvarmning af reaktionen fartøj til 35 ° C, ved hjælp af en vand-kappe reaktion fartøj, er med til at drive reaktion. For højt flygtige aminer såsom isopropylamin, skal udvises forsigtighed for at undgå fordampning. Aminer i form af en HCl-salt, såsom T-butyl beta-alanin HCl, skal være fri-baseret, inden de indsættes i fordrivelse reaktion. Dette kan opnås ved at opløse eller suspendere amin i DCM (~ 5g amine/25 ml DCM), og neutralisering med en ækvimolære opløsning af vandig natriumhydroxid i en skilletragt. Den DCM lag er indsamlet, og den vandige lag bliver vasket med ekstra DCM. Den kombinerede DCM lag er tørret over natriumsulfat og filtreret ind i en tareret rundkolbe. Fjern opløsningsmiddel ved roterende fordampning til at give en olie, og registrere produktet vægt. During spaltningen skridt, TFA kavalergang cocktail og spaltning tid er afhængig af antallet og variationen af ​​at beskytte anvendte grupper. Retningslinjer for spaltning cocktails ligner traditionelle peptid deprotection skel 1. Generelt er 10 minutter inkubationer kræves for sekvenser uden at beskytte grupper eller sekvenser med få meget syrelabil beskytte grupper (f.eks BOC, trityl). To timers inkubationer anbefales til sekvenser med mere vanskeligt at beskytte grupper (fx t-butyl ester, MTR, T) eller sekvenser med mange beskytte grupper for at sikre fuld deprotection i hver kæde. Rå peptoid produkter vil normalt opløses i acetonitril: vand 1:1 (v / v), men højere acetonitril Proportionerne er fælles med sidekæder med en høj samlet hydrofobicitet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Dimethylformamid </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99 +% </td></tr><tr><td> N-methylpyrrolidinone </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Bromoacetic Acid </td><td> ACROS Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4-Methylpiperidine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide </td><td> Chem-Impex </td><td> 001100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Dichlormethan </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS klasse </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Trifluoreddikesyre </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 233781 -10G </td><td> For TFA spaltning </td></tr><tr><td> 1,2-dichlorethan </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> For siliconization af glas reaktionsbeholdere </td></tr><tr><td> Phenethylamine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 407267-100ML </td><td> &gt; 99,5% Hydrofobisk side-chain amin </td></tr><tr><td> BOC-ethylendiamin </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Kationiske side-chain amin </td></tr><tr><td> t-Butyl beta-alanin HCl </td><td> Chem-Impex International </td><td> 04407 </td><td> Anioniske side-chain amin </td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic syre </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> For MALDI matrix </td></tr><tr><td> Nile Red </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 19123-10mg </td><td> For fluorescens Imaging </td></tr><tr><td> Dichlorodimethylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 80430-500G-F </td><td> For siliconization af glas reaktionsbeholdere </td></tr><tr><td> Engangs PP fritted indkøbskurvenhøjderyg </td><td> Anvendt separationer </td><td> 2416 </td><td> 6 ml polypropylen-patron med 20 mm PE Frit </td></tr><tr><td> Engangs 3-vejs luer adapter </td><td> Cole Parmer </td><td> 31200-80 </td><td> Stophane for engangsemballage manuel syntese reaktionsbeholder </td></tr><tr><td> Luer Låsering </td><td> Cole Parmer </td><td> 45503-19 </td><td> ¼ &quot;gevindnippel for engangsemballage manuel syntese reaktionsbeholder </td></tr><tr><td> Fittings Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45500-20 </td><td> ¼ &quot;gevindnippel for engangsemballage manuel syntese reaktionsbeholder </td></tr><tr><td> Engangs PP pipetter </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> For TFA overførsler </td></tr><tr><td> Luer lock plastiksprøjte </td><td> National Scientific </td><td> S7515-5 </td><td> 6 ml sprøjter </td></tr><tr><td> 1 dram hætteglas </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Med phenol-formet skruelåg med PVC-konfronteret papirmasse liner </td></tr><tr><td> 20 mL scintillation hætteglas </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Med vedlagte PP hætte og papirmasse folie liner </td></tr><tr><td> Sikker-Seal lim spacer </td><td> Invitrogen </td><td> S-24736 </td><td> For fluorescens billedbehandling </td></tr><tr><td> Glas dias </td><td> Electron Microscopy Fakultet </td><td> 63411 </td><td> For fluorescens billedbehandling </td></tr><tr><td> Cover slip </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> For fluorescens billedbehandling </td></tr><tr><td> 4 &quot;Silicon wafer </td><td> Ted Pella </td><td> 16007 </td><td> Pre-terninger i 5x7 mm chips </td></tr><tr><td> 0,45 filter </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> For HPLC. PTFE-membran </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> BD </td><td> 212272 </td><td> For fluorescens billedbehandling </td></tr><tr><td> SPE Vacuum Manifold </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 57044 </td><td> Eksempel på SPE vakuummanifolden </td></tr><tr><td> Fritted glasbeholder </td><td> Ace glas </td><td> 6402-12 </td><td> Porøsitet CFrit </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Sterilizer </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Eksempel på plasma renere at forberede siliciumchips for SEM </td></tr></tbody></table>

solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets

Peptoids er en ny klasse af biomimetiske, ikke-naturlige, sekvens-specifikke heteropolymers at modstå proteolyse, udviser potent biologisk aktivitet, og vend det i højere orden nanostrukturer. Strukturelt ligner peptider, peptoids er poly nitrogensubstituerede Glycines, hvor sidekæder er knyttet til kvælstof i stedet for alpha-kulstof. Deres lethed af syntese og strukturelle mangfoldighed tillader afprøvning af grundlæggende design principper til at køre bil de novo design og konstruktion af nye biologisk aktive og nanostrukturerede materialer. Her er en simpel manuel peptoid syntese protokol, præsenteret som gør det muligt syntesen af ​​langkædede polypeptoids (op til 50mers) i fremragende udbytte. Kun grundlæggende udstyr, enkle teknikker (f.eks væsketransport, filtrering), og kommercielt tilgængelige reagenser er påkrævet, hvilket gør peptoids en tilgængelig foruden mange forskere &#39;værktøjskasser. Den peptoid backbone er vokset en monomer ad gangen modbl.a. den submonomer metode, som består af en to-trins monomer Ud cyklus: acylation og fordrivelse. Først bromoacetic Syreaktiveret in situ med N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide acylates en resin-bundet sekundære amin. For det andet, nukleofile forskydning af bromid ved en primær amin følger at indføre sidekæde. De to-trins cyklus gentages indtil den ønskede kædelængden er nået. Koblingen effektiviteten af ​​denne to-trins cyklus rutinemæssigt overstiger 98% og muliggør syntesen af ​​peptoids så længe som 50 rester. Meget afstemmelige, præcis og kemisk forskellige sekvenser er opnås med den submonomer metode som hundredvis af let tilgængelige primære aminer kan være direkte indarbejdet. Peptoids dukker op som et alsidigt biomimetiske materiale til Nanobioscience forskning på grund af deres syntetiske fleksibilitet, robusthed, og bestille på det atomare niveau. Den foldning af en enkelt kæde, amfifile, information-rige polypeptoid til en yderst bestilt nanosheet blev for nylig demonstreret. Dette peptoid er en 36-mer, der kun består af tre forskellige kommercielt tilgængelige monomerer: hydrofobe, kationiske og anioniske. Den hydrofobe phenylethyl sidekæder er begravet i nanosheet kernen mens ioniske amin og carboxyl sidekæder justere på den hydrofile ansigter. Den peptoid nanosheets tjene som en potentiel platform for membran mimetika, protein mimetika, enhed fabrikation, og sensorer. Metoder til peptoid syntese, ark dannelse, og mikroskopi billedbehandling er beskrevet og giver en enkel metode til at sætte fremtidens peptoid nanosheet designs.

Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

En enkel og generel manuelle peptoid syntese metode, som indebærer grundlæggende udstyr og kommercielt tilgængelige reagenser er beskrevet, så peptoids at være let syntetiseret i de fleste laboratorier. Den syntese, oprensning og karakterisering af en amfifile peptoid 36mer beskrives, såvel som dens saml-selv i højt bestilt nanosheets.

Fast-fase Submonomer Syntese af Peptoid polymerer og deres saml-selv i Meget-Bestilt Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Instrueret Cellular saml-selv at fabrikere Cell-afledt Tissue Ringe til Biomekanisk analyse og Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontrol af levende celler Elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

Fremstilling af en Dipol-assisteret Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analyse i vandprøver

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntese af Gold Nanopartikel Integrated Foto-responsive Liposomer og måling af deres Mikroboble Kavitation på Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

High-throughput bestemmelse af bakterier Repellent Polymerer til medicinsk udstyr

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Opdigte nedbrydelige Thermoresponsive Hydrogels på flere længdeskalaer via reaktive ekstrudering, mikrofluidik, samlesæt, og Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntese af kationiseret Magnetoferritin for Ultrahurtig magnetisering Celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molekylær Anerkendelse med Bio-mimetiske Polymerer på Single Walled kulstofnanorør

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Ammoniak syntese ved lavt tryk

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...