Name: solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

De auteurs willen graag Byoung-Chul Lee, Philip Choi en Samuel Ho bedanken voor waardevolle hulp. Dit werk werd uitgevoerd op de Moleculaire Foundry in het Lawrence Berkeley National Laboratory, die wordt ondersteund door het Office of Science, Bureau van Basic Energy Sciences, van het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract nummer DE-AC02-05CH11231 en de Defense Threat Reduction agentschap onder overeenkomst nr.: IACRO-B0845281.

1. Solid-Phase Submonomer Synthese van Polypeptoids Vaste-fase synthese (SPS) is een veelgebruikte techniek gebruikt voor het synthetiseren sequentie-specifieke biopolymeren stapsgewijs, direct op een inerte vaste drager, zoals een polymeer hars kraal. Hoge koppeling opbrengsten en het gemak van overtollige reactant verwijderen zijn belangrijkste voordelen van SPS. Na een koppeling reactie op de hars, worden overtollige reagentia gewoon afgetapt en de parels worden gewassen om klaar te zijn voor de volgende reactiestap. Na de laatste synthese reactie, worden de volledige lengte oligomeren gesplitst van de hars en de oplossing-fase materiaal kan verder worden bestudeerd. Hier passen we de SPS-procedure om de sequentie-specifieke peptoïde polymeren te genereren. <ol><li> Setup: Alle stappen van de handleiding peptoïde synthese kan worden uitgevoerd in een wegwerp, polypropyleen (PP) gefrit cartridge of een gesinterde glazen reactievat uitgerust met een 3-weg kraan. Voer alle activiteiten in een zuurkast. Voor incubaties in de glass schip of plastic cartridge, sluit u het ene arm een ​​toevoer van stikstof om zachtjes bel de oplossing voor een goede menging. Als alternatief voor de reactie incubaties in de wegwerp cartridge seal beide uiteinden van de cartridge met doppen en leg ze op een roterende schudder. De reactie mengsels of wast drain,, dient u vacuüm huis via een verspilling val. Het schip moet gefrit met een grove frit. Siliconize het glazen reactievat om kralen te voorkomen van het vasthouden aan de wanden van het glazen vat. Bereid een oplossing van 5% dichlorodimethylsilane in dichloorethaan (v / v). Vul een schone en droge reactievat naar de top met siliconizing oplossing, laat zitten voor 30 minuten, daarna uitlekken. Ze wast het vat met DCE en daarna een keer met methanol. De siliconizing oplossing kan worden hergebruikt, zodat het moet worden opgeslagen. Ofwel de lucht droog of schud de overtollige oplossing en bak de glaswerk tot het droog is na het verwijderen van de kraan. Cool reactievat voor het toevoegen van hars. </li><li> Voeg 100 mg (0,06 mmol) van Rink amide rezonde om een ​​gesinterde reactievat. Zwellen de hars door het toevoegen van 2 ml dimethylformamide (DMF). Schud door schudden of borrelen gedurende 10 minuten. Giet de oplossing door een vacuüm aan de zwol hars te isoleren. </li><li> Voeg 1 ml van 20% 4-methylpiperidine in DMF (v / v) om de Fmoc groep DEPROTECT. Roeren gedurende 2 minuten en giet af. Herhaal dit met een 12 minuten incubatie. </li><li> Spoel de hars door het toevoegen van 2 ml van DMF, schudden gedurende 15 seconden, en aftappen. 3x te herhalen. </li><li> Bromoacetylation: Voeg 1 mL 0,6 M broomazijnzuur (0,6 mmol) in DMF en 86 uL van N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (0,93 equivalent, 0,56 mmol). Incubeer met zachte borrelen gedurende 30 minuten, daarna uitlekken en spoel na met 2 ml van DMF (herhaal 4x). </li><li> Verplaatsing: Voeg 1 mL van 1-2 M amine in N-methylpyrrolidinone. Incubeer met borrelende voor 30 tot 120 minuten, daarna uitlekken en spoel met DMF (4x 2 ml). </li><li> Blijf de peptoïde keten groeien door het herhalen van de submonomer cyclus, stappen 1.5 (bromoacetylation) en 1.6 (displacement). </li></ol><ol start="8"><li> Na de laatste verplaatsing wordt gedaan, spoel met 2 ml van DMF (herhaling 4x), vervolgens 2 ml dichloormethaan (herhaal 3x). Cap en bewaar het reactievat tot decollete. </li><li> Pauze in synthese (optioneel): Om te pauzeren tijdens een peptoïde synthese, afwerking de verplaatsing reactie en ga verder met stap 1.8. Blijven groeien het peptoïde keten, start u de synthese door het opnieuw zwelling van de gedroogde hars (stap 1.2) en het herhalen van de submonomer cyclus (stap 1.5 en 1.6). De hars kan worden gedroogd en opgeslagen na elke verplaatsing, behalve de 2de verplaatsing, omdat de hars-peptoïde conjugaat kan een cyclisch diketopiperazine kant product te vormen. </li><li> Voor meerdere gelijktijdige syntheses, is een vaste-fase-extractie vacuüm manifold aanbevolen om de efficiëntie te maximaliseren. Peptoïde synthese kan ook geautomatiseerd worden door een juiste programmering methoden in de handel verkrijgbare peptide synthesizers, zoals de Aapptec Apex 396, CEM Liberty magnetron synthesizer en Proteïne Technologies Inc Prelude synthesizer. </li></ol> 2. Splitsing en Side-Chain deprotectie <ol><li> Breng alle gedroogde hars om een ​​20 ml scintillatie glazen flacon. </li><li> Werken binnen een kap en het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, voeg 4 ml trifluorazijnzuur (TFA) splijten cocktail 1 (bijv. 95% aq. TFA, zie bespreking) om de scintillatie glazen flesje en de dop stevig vast. Schud gedurende 10 minuten tot 2 uur bij kamertemperatuur (zie bespreking). </li><li> Verzamel de TFA klieving oplossing door het filteren van de hars door een wegwerp, PP gefrit patroon in een nieuw, vooraf gewogen 20 mL scintillatie glazen flacon. Een wegwerp, PP pipet is het handig om de splitsing cocktail oplossingen te dragen. </li><li> Voeg 1 ml vers decollete cocktail aan de hars spoelen en eventueel resterende peptoïde te verzamelen. Herhaal 2x. </li><li> Verdampen TFA door te blazen een zachte stroom van stikstof of met behulp van een Biotage V10 verdamper. </li><li> Neem het ruwe olie in 6 mLvan acetonitril / water 01:01 (v / v) voor HPLC. Freeze en lyophilize. Herhalen. </li><li> Registreer het gewicht van het ruwe product. Op te slaan als een droog poeder bij -20 ° C </li><li> Test splitsing (optioneel): Een test decollete op 0,5% van de hars kan worden uitgevoerd om snel te bepalen van de zuiverheid en de massa van de gesynthetiseerde peptoïde en of de juiste decollete omstandigheden waren gekozen. Test breuklijnen zijn vooral nuttig om de voortgang van de synthese monitor. </li></ol> 3. Karakterisering en zuivering van de Polypeptoid <ol><li> Door een combinatie van analytische HPLC, electrospray LC-MS, en / of MALDI-TOF, bepalen de zuiverheid van het ruwe product en of het gewenste molecuulgewicht aanwezig is. </li><li> Bereid een ~ 5-10 mg / ml oplossing van het droge peptoïde poeder in water met een minimale acetonitril als nodig is voor de oplosbaarheid. Filter heldere oplossing van ruwe peptoïde product met 0,45 pm spuitfilter om stof en deeltjes te verwijderen. </li><li> Analytische HPLC en electrospray LC-MS: Maak een ~ 20 pg / ml ruwe peptoïde oplossing. Filter 200 pi met een 0,45 um filter en injecteer 20 pi. </li><li> MALDI: Meng 1 pi van ~ 20 mg / ml peptoïde met 1 pi matrix. Spot een ui op de MALDI plaat en aan de lucht laten drogen. Matrix-en acquisitie-modus is afhankelijk van de steekproef (Fig. 5). </li><li> Zuiveren de ruwe peptoïde mengsel met reverse-fase HPLC prep. Kies de gradiënt en kolom (C4 of C18) op basis van de hydrofobiciteit van polypeptoid. Combineer gezuiverde fracties, te bevriezen, en lyophilize, wat resulteert in een luchtig wit poeder. Registreer het gewicht van het eindproduct. </li><li> Vorming van HCl zout (optioneel): Neem het gevriesdroogd poeder in 100 mM HCl (Aqua.) met minimale acetonitril. Transfer naar de pre-gewogen glazen flacon. Freeze en de re-lyophilize. Herhaal 2x. Weeg de massa van het peptoïde poeder te bepalen. </li></ol> 4. Peptoïde Nanosheet Formation Dit gedeelte describes het protocol om vellen te vormen van een single-chain, sequentie-specifieke, amfifiele 36-mer peptoïde (fig. 1). Nadat de peptoïde streng wordt gesynthetiseerd, gezuiverd, en gevriesdroogde zoals hierboven beschreven, wordt de resulterende witte poeder opgelost in DMSO om een ​​2 mM stockoplossing te maken. <ol><li> Bereid 500 pi van 20 uM peptoïde oplossing in bladvorming buffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 in water) in een 1 dram glazen flacon. Voeg eerst 445 ul Milli-Q water, 50 uL van 10x bladvorming buffer, en vortex te mengen. Dan, voeg 5 pi van 2 mM peptoïde stockoplossing aanwezig zijn en voorzichtig swirl oplossing. Cap de glazen flacon. </li><li> Platen worden gevormd door het zachtjes bewegen van het verdunde waterige peptoïde oplossing. Langzaam kantelen van de glazen flacon uit de horizontale positie naar de rechtop resultaten in vellen. Zachtjes schudden levert ook platen, maar de bladen zijn meestal kleiner en met minder rechte randen. Een grondige analyse van de bladvorming mechanisme reported afzonderlijk. 2 </li><li> Voor veel van hoge kwaliteit lakens, langzaam draai de glazen flesjes over de horizontale as (&lt;1 RPM) voor een tot drie dagen. Een adequate technische middelen RKVSD Rotamix buis rotator of een aangepaste rocker continu kan dit doen. </li><li> Dialyse van nanosheets (optioneel): In bepaalde toepassingen kan het nodig zijn om elke vrije peptoïde kettingen of buffers / zouten te verwijderen. Geniet van een Float-a-Lyzer 100 kD membraan in de gewenste buffer gedurende 15 minuten. Belasting 500 pL peptoïde vel oplossing in het monster kamer. Soak in 500 ml van de gewenste buffer, roeren met een magnetische roerstaaf bij 60 rpm. Laat dialyse van platen om door te gaan gedurende 4 uur. Elk uur, uitwisseling met een verse voorraad van bufferoplossing. </li></ol> 5. Fluorescentie microscopie van nanosheets <ol><li> Fluorescentie beelden van de nanosheets werden afgebeeld met Nile Red, een milieuvriendelijke kleurstof waarvan fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer het wordt gelokaliseerd in hydrophobic omgevingen (afb. 2). </li><li> Voeg 1 ul van 100 uM Nijl Rood naar 100 pi van de nanosheet oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM van Nile Red verkrijgen. </li><li> Maak een 1% agarose-oplossing in heet water en giet het in een plastic petrischaal. Zorg ervoor dat de agarose oplossing is ongeveer 1 / 8 inch dik en laat de oplossing ongestoord afkoelen op een vlakke ondergrond. Na de agarose sets, gebruik een spatel om te knippen en een overdracht cm x 1 cm vierkantjes op een glasplaatje. </li><li> Om de platen verzamelen in hetzelfde vlak, ter plaatse een pi van plaatstaal oplossing op het stuk van de agarose. Laat de agarose om de buffer te absorberen gedurende 2 minuten, waardoor de vellen aan de oppervlakte. Afbeelding binnen 15 minuten, anders wordt de agarose zal beginnen te vervormen als gevolg van uitdroging. </li><li> Om de afbeelding te vellen in de oplossing, load 15 uL binnen een diameter van 20 mm 0,12 mm pakking op een glasplaatje. Dek af met een dekglaasje aan. Indien de platen zijn gewoon ingeklemd tussen een glasplaatje en dekglaasje zonder een pakking, een groot aantal vellen will afschuiving en de ogenschijnlijk kleine verdamping zorgt ervoor dat de bladen voortdurend te verplaatsen. </li><li> Afbeelding platen onder epifluorescentie verlichting (bv. een Olympus IX81 omgekeerde microscoop uitgerust met een Andor iXonEM + EMCCD spectra met een Texas rode filter). </li></ol> 6. Scanning Electron Microscopy (SEM) van nanosheets <ol><li> Plasma etsen van siliconen substraat (optioneel): De silicium chips worden geëtst plasma om te helpen bij de adsorptie van de vellen. Plaats de silicium chips in de vacuümkamer van een plasma cleaner (bv Harrick Plasma Cleaner / Sterilisator PDC-32G). Pomp tot 200 mTorr en zet de RF-spoel naar 18W (hoge instelling voor PDC-32G). Etch gedurende 2 minuten. </li><li> Drop 20 pi van peptoïde plaat oplossing op een plasma-behandelde silicium substraat. Laat zitten voor 3 minuten. Verwijder de overtollige oplossing met een tip van Kim-af te vegen. Pipetteer 20 ui van het water op het oppervlak en opnieuw verwijderen overtollige oplossing voor buffer en zouten te verwijderen. Herhalen 4x. </li><li> U kunt ook bellenyze de peptoïde vel oplossingen tegen het water te bufferen en zout te verwijderen. Drop 20 pi van gedialyseerd plaat oplossing op plasma-behandelde silicium substraten. De lucht drogen het monster. </li><li> Afbeelding vellen met SEM (bijv. Zeiss Tweeling Ultra-55 Analytische Scanning Electron Microscope) met een in-lens detector en op balk energieën tussen 1 kV en 5 kV (afb. 3). </li></ol> 7. Veiligheid Opmerkingen: <ol><li> Dimethylformamide en dichloormethaan zijn redelijk vermoeden van kankerverwekkende stoffen. </li><li> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine en broomazijnzuur gevaarlijk zijn voor de huid, ogen en luchtwegen. Zij moeten worden gebruikt in de kap met zorg. Het kan giftig zijn bij inademing of geabsorbeerd door de huid, en de blootstelling kan leiden tot sensibilisering. Lege verpakkingen bevatten resten product (vloeistof / damp) en moeten grondig worden gereinigd voordat u ze uit de motorkap. </li><li> TFA is een sterk zuur, en is uiterst destructief voor de bovenste luchtwegen, de ogen enhuid. TFA is ook geconcentreerd oplossingen van TFA-vluchtige te houden in de kap te allen tijde aan de luchtwegen schade te voorkomen. Gebruik de juiste PPE, en voorzichtigheid bij het hanteren van oplossingen van TFA. Veranderen handschoenen direct als ze in contact komen met TFA, en onmiddellijk gemorst. </li></ol> 8. Representatieve resultaten: Deze paragraaf beschrijft de synthese, karakterisering, en zuivering van een sequentie-specifieke 36-mer peptoïde keten, opvouwbaar tot een sterk geordende nanosheet 3 (fig. 1). Het blok-charge peptoïde H-[Nae-NFE] 9 - [NVU-NPE] 9-NH 2 werd gesynthetiseerd op 100 mg van Rink amide hars. Een 2 M amine-oplossing werd gebruikt voor alle verplaatsing reacties, die werden uitgevoerd gedurende 60 minuten voor residu 1-18 en 120 minuten voor residu 19-36. t-butyl beta-alanine HCl werd omgezet in de vrije base (zie bespreking), terwijl fenethylamine en BOC-ethyleendiamine werden beide gebruikt directly. De hars werd gesplitst met 95% TFA, 2,5% triispropylsilane, 2,5% water gedurende 2 uur. TFA werd verdampt en de resulterende viskeuze olie (~ 180 mg) werd opnieuw opgelost in 6 ml acetonitril: water 01:01 (v / v). Zuiverheid van het product (afb. 4) en de aanwezigheid van het product massa werd bevestigd door van analytische RP-HPLC (30-80% acetonitril in water helling, beide met 0,1% (v / v) TFA, op 1 ml / min gedurende 30 minuten bij 60 ° C met een C18, 5 um, 50 X 2 mm kolom) en de MALDI (afb. 5). Zuivering met omgekeerde fase HPLC op een C18 kolom Vydac (10 urn, 22 mm x 250 mm) ging, met behulp van een gradiënt van 30-60% acetonitril in water met 0,1% TFA over 60 minuten bij 10 ml / min. De kolom werd geladen met 60 mg van ruwe product voor elke chromatografische reeks. De gezuiverde fracties werden gecombineerd op basis van zuiverheid van analytische RP-HPLC (afb. 4) en gevriesdroogd tot ~ 80 mg van een pluizige witte poeder te leveren. Gezuiverd block-charge peptoïde moleculairegewicht werd bevestigd door MALDI. 1 pi van 100 uM gezuiverd peptoïde in acetonitril: water 01:01 (v / v) werd gemengd met een pi van de matrix (5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur in acetonitril: water 1:1 v / v en 0,1% TFA) en 1 pi werd gespot op de MALDI plaat. Nadat het monster lucht gedroogd, werd het geplaatst in de Applied Biosystem / MDS Sciex 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer. Het verwerven en verwerken modes waren lineair lage massa. De berekende gewicht is ingevoerd in het beoogde massa automatisch aan te passen voor de vertragingstijd. De laser intensiteit was ingesteld op 3400. De waargenomen massa, 4981,2, sluit nauw aan op de berekende massa van 4981,74. Het gevriesdroogde gezuiverde poeder werd opgelost in DMSO om een ​​2 mM voorraad-oplossing, die kan worden opgeslagen bij 4 ° C te maken Vellen werden bereid door de eerder genoemde protocol en afgebeeld met fluorescentie optische microscopie en SEM (Fig. 2 en 3). Een verscheidenheid van vormen met functie maten die kan oplopen tot 300 micrometer worden waargenomen, en notably, rechte randen op de voorgrond. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" /> Figuur 1 Volgorde van het blok-charge peptoïde H-[Nae-NFE] 9 -. [NVU-NPE] 9-NH 2. Een single-keten, blok lading, amfifiele polypeptoid 36-mer zelf-assembleert in zeer geordende, twee-dimensionale nanosheets 3. De berekende molecuulgewicht is 4981,74. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" /> Figuur 2. Fluorescentie microscopie beelden van peptoïde nanosheets. Platen werden gevormd uit een 20 uM peptoïde-oplossing in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. De platen werden belicht op agarose met 1 uM Nijl Red. Schaal bars zijn 100 micrometer. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" /> Figuur 3. Scanning electronen microscopie beeldenvan peptoïde nanosheets. Platen werden gevormd uit een 20 uM peptoïde-oplossing in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Schaal bars zijn 5 micrometer. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" /> Figuur 4 Analytische reverse-fase HPLC spoor van H-[Nae-NFE] 9 -. [NVU-NPE] 9-NH 2. De ruwe en gezuiverd analytische HPLC trace (30-80% helling op 1 ml / min gedurende 30 minuten bij 60 ° C met een C18, 5 um, 50 x 2 mm kolom) van de ruwe en gezuiverde block-charge peptoïde H-[ Nae-NFE] 9 - [NVU-NPE] 9-NH 2 wordt getoond. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" /> Figuur 5 MALDI-TOF massaspectrometrie spoor van H-[Nae-NFE] 9 -. [NVU-NPE] 9-NH 2. De waargenomen massa, 4981,2, is in nauw overleg met de berekende massa, 4981,74.

<ol>
	<li>King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cleavage+method+which+minimizes+side+reactions+following+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis.">A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).</li><li>Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaken,+not+stirred:+Collapsing+a+peptoid+monolayer+to+produce+free-floating,+stable+nanosheets.">Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets.</a> J. Am. Chem. Soc. , (2011).</li><li>Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+single-chain,+information-rich+polypeptoid+sequence+into+a+highly-ordered+nanosheet.">Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet.</a> Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+multistep+synthesis+of+a+bioactive+peptidomimetic+oligomer+for+the+undergraduate+laboratory.">Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory.</a> J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).</li><li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+peptoids:+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function.">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).</li><li>Zuckermann, R. N., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+as+potential+therapeutics.">Peptoids as potential therapeutics.</a> Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).</li><li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+that+mimic+the+structure,+function+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides.">Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> , 105-2794 (2008).</li><li>Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+method+for+detection+of+amyloidogenic+misfolded+proteins.">A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins.</a> Biochem. 50, 4322-4329 (2011).</li><li>Huang, C. -. Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipitoids+-+novel+cationic+lipids+for+cellular+delivery+of+plasmid+DNA+in+vitro.">Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro.</a> Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).</li><li>Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Br&#228;se, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoidic+amino-+and+guanidinium-carrier+systems:+Targeted+drug+delivery+into+the+cell+cytosol+or+the+nucleus.">Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li><li>Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+a+biomimetic+diblock+copolypeptoid+into+homochiral+super+helices.">Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).</li><li>Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+ultra-thin+two-dimensional+crystals+from+sequence-specific+peptoid+polymers.">Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers.</a> Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+synthesis+of+artificial+proteins:+The+Discovery+of+an+amphiphilic+helical+peptoid+assembly.">Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly.</a> Chemistry &#38; Biology. 9, 647-654 (2002).</li><li>Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combinatorial+approach+to+the+discovery+of+efficient+cationic+peptoid+reagents+for+gene+delivery.">A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).</li><li>Mora, P. u. i. g., Masip, I. s. a. b. e. l., Cort&#233;s, N. u. r. i. a., Marquina, R. e. g. i. n. a., Merino, R. a. m. &. #. 2. 4. 3. ;. n., Merino, J. e. s. &. #. 2. 5. 0. ;. s., Carbonell, T. e. r. e. s. a., Mingarro, I. s. m. a. e. l., Messeguer, A. n. g. e. l., P&#233;rez-Pay&#225;, E. n. r. i. q. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+from+a+positional+scanning+peptoid+library+of+in+vivo+active+compounds+that+neutralize+bacterial+endotoxins.">Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins.</a> J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).</li><li>Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+(N-substituted)glycine+peptoid+Library.">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li><li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library.">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-(substituted)glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+(&amp;alpha;+peptoids)+and+derivatives.">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&amp;alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis.">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li></ol>

We hebben niets te onthullen.

Toepassingen en betekenis Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor het peptoïde synthese en de waterige zelf-assemblage van de peptoids in nanosheets. De meeste laboratoria zijn gemakkelijk in staat om synthetiseren peptoids omdat goedkope materialen, basis kennis en eenvoudige technieken worden gebruikt 4. Ook de zelf-assemblage van ultra-dunne, zeer besteld nanosheets vereist immers enkel herhaald kantelen van een flacon met een verdunde waterige oplossing peptoïde 2. Peptoids zijn veelbelovende materialen voor biomedische en nanowetenschap onderzoek, omdat ze zijn robuust en flexibel synthetisch toch sequentie-specifieke en zeer afstembare 5. Peptoids hebben aangetoond biologische activiteit (therapeutica 6,7, diagnostiek 8, intracellulaire aflevering 9-10) en vouwen in hiërarchische nanostructuren 3, 11-14. Door hun modulaire synthese, combinatorische peptoïde LibrRam 15-19 gemakkelijk kan worden gesynthetiseerd en gescreend voor een brede reeks van activiteiten of eigenschappen. Met name de nanosheets dienen als een potentieel platform voor twee-dimensionale weergave steigers, membraan mimetica, biologische sensoren, eiwit mimetica en het apparaat fabricage. Met de vrijwel onuitputtelijke verschillende sequenties mogelijk is, is het rijk van peptoïde onderzoek snel uit te breiden. Variabelen in vaste-fase synthese van submonomer polypeptoids Vanwege de mogelijkheid om te kiezen uit een ongelooflijk groot en divers alfabet van de monomeren 20, de submonomer methode moet af en toe wijzigingen voor de gevallen waarin het verhogen van de koppeling efficiëntie van elke stap zal de totale opbrengst product te verbeteren. Oprichting van onbeschermde heterocyclische zijketens vereist het gebruik van chloorazijnzuur in plaats van broomazijnzuur 21. Langere verplaatsing en hogereamine-concentraties zijn meestal in dienst na ongeveer 20 koppelingen voor lange peptoïde sequenties of minder nucleofiele amines. Het verwarmen van het reactievat tot 35 ° C, met behulp van een water-mantel reactievat, helpt om te rijden de reactie. Voor zeer vluchtige aminen zoals isopropylamine, moet erop worden gelet om de verdamping te voorkomen. Aminen in de vorm van een HCl-zout, zoals t-butyl beta-alanine HCl, moeten vrij-based alvorens te worden ingevoerd in de verplaatsing reactie. Dit kan worden bereikt door het oplossen of schorsing van de amine in DCM (~ 5 g amine/25 mL DCM), en neutraliseren met een equimolaire oplossing van waterig natriumhydroxide in een scheitrechter. De DCM laag is verzameld en de waterige laag wordt gewassen met extra DCM. De gecombineerde DCM lagen worden gedroogd over natriumsulfaat en gefilterd in een vooraf gewogen rondbodemkolf. Verwijder oplosmiddel door roterende evaporatie om een ​​olie-opbrengst, en noteer de gewicht van het product. During de splitsing stap, TFA decollete cocktail en decollete tijd is afhankelijk van het aantal en de verscheidenheid van de bescherming van gebruikte groepen. Richtlijnen voor splitsing cocktails zijn vergelijkbaar met de traditionele peptide ontscherming splitsingen 1. Over het algemeen worden 10 minuten incubaties die nodig is voor sequenties zonder beschermende groepen of sequenties met een paar zeer zuur labiele beschermende groepen (bv BOC, trityl). Twee uur incubaties worden aanbevolen voor sequenties met moeilijkere beschermende groepen (bv t-butyl ester, Mtr, Pbf) of sequenties met veel beschermende groepen tot volledige verwijdering van de bescherming van elke keten te garanderen. Ruwe peptoïde producten zal in het algemeen op te lossen in acetonitril: water 01:01 (v / v), maar hoger acetonitril verhoudingen zijn gemeen met zijketens met een hoge totale hydrofobiciteit.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Dimethylformamide </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99 +% </td></tr><tr><td> N-methylpyrrolidinone </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Broomazijnzuur </td><td> Acros Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4-Methylpiperidine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide </td><td> Chem-Impex </td><td> 001100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Dichloormethaan </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS kwaliteit </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Trifluorazijnzuur </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 233781 -10G </td><td> Voor TFA decollete </td></tr><tr><td> 1,2-dichloorethaan </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> Voor siliconization van glas reactievaten </td></tr><tr><td> Phenethylamine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 407267-100ML </td><td> &gt; 99,5% hydrofobe zijketen amine </td></tr><tr><td> Boc-ethyleendiamine </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Kationische zijketen amine </td></tr><tr><td> t-butyl beta-alanine HCl </td><td> Chem-Impex International </td><td> 04407 </td><td> Anionische zijketen amine </td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> Voor de MALDI matrix </td></tr><tr><td> Nijl Red </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 19123-10MG </td><td> Voor fluorescentie beeldvorming </td></tr><tr><td> Dichlorodimethylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 80430-500G-F </td><td> Voor siliconization van glas reactievaten </td></tr><tr><td> Wegwerp PP gefrit winkelwagennok </td><td> Toegepaste Scheidingen </td><td> 2416 </td><td> 6 ml polypropyleen patroon met 20 mm PE-frit </td></tr><tr><td> Wegwerp 3 weg luer-adapter </td><td> Cole Parmer </td><td> 31200-80 </td><td> Kraan voor eenmalige handmatige synthese reactievat </td></tr><tr><td> Luer Lock ring </td><td> Cole Parmer </td><td> 45503-19 </td><td> ¼ &quot;aansluiting voor disposable handmatige synthese reactievat </td></tr><tr><td> Fittings Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45500-20 </td><td> ¼ &quot;aansluiting voor disposable handmatige synthese reactievat </td></tr><tr><td> Wegwerp PP pipetten </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> Voor TFA transfers </td></tr><tr><td> Luer-lock plastic spuit </td><td> Nationale Wetenschappelijke </td><td> S7515-5 </td><td> 6 ml spuiten </td></tr><tr><td> 1 dram glazen flacon </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Met fenol gegoten schroefdop met polyvinyl-faced pulp liner </td></tr><tr><td> 20 ml SCINtillation flacon </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Met aangehechte PP dop en pulp folie liner </td></tr><tr><td> Secure-Seal lijm spacer </td><td> Invitrogen </td><td> S-24736 </td><td> Voor fluorescentie beeldvorming </td></tr><tr><td> Objectglaasjes </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63411 </td><td> Voor fluorescentie beeldvorming </td></tr><tr><td> Dekglas </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> Voor fluorescentie beeldvorming </td></tr><tr><td> 4 &quot;Silicium wafer </td><td> Ted Pella </td><td> 16007 </td><td> Pre-dobbelstenen in 5x7 mm chips </td></tr><tr><td> 0.45 filter </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> Voor HPLC. PTFE-membraan </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> BD </td><td> 212272 </td><td> Voor fluorescentie beeldvorming </td></tr><tr><td> SPE Vacuum Manifold </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 57044 </td><td> Voorbeeld van een SPE vacuüm manifold </td></tr><tr><td> Gefrit glazen vat </td><td> Ace glas </td><td> 6402-12 </td><td> Porositeit Cfrit </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Sterilisator </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Voorbeeld van een plasma cleaner om silicium chips voor te bereiden op SEM </td></tr></tbody></table>

solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets

Peptoids zijn een nieuwe klasse van biomimetische, niet-natuurlijke, sequentie-specifieke heteropolymers dat proteolyse verzetten, vertonen sterke biologische activiteit, en vouwen in de hogere orde nanostructuren. Structureel vergelijkbaar met peptiden, peptoids zijn poly N-gesubstitueerde glycines, waarbij de zijketens zijn bevestigd en niet aan de stikstof dan de alfa-koolstof. Hun gemak van de synthese en structurele diversiteit maakt het testen van de fundamentele ontwerpprincipes om te rijden de novo design en engineering van nieuwe biologisch-actieve en nanogestructureerde materialen. Hier is een eenvoudige handleiding peptoïde synthese-protocol gepresenteerd die het mogelijk maakt de synthese van lange keten polypeptoids (tot 50mers) in uitstekende rendementen. Alleen basisuitrusting, eenvoudige technieken (bijv. vloeibaar overdracht, filtratie), en in de handel verkrijgbare reagentia nodig zijn, maken peptoids een toegankelijke aanvulling op veel onderzoekers &#39;toolkits. De peptoïde backbone wordt gekweekt een monomeer in een tijd vonder meer de submonomer methode die bestaat uit een twee-staps monomeer Naast cyclus: acylering en verplaatsing. De eerste, broomazijnzuur in situ geactiveerd met N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide acylates een harsgebonden secundaire amine. Ten tweede, nucleofiele verplaatsing van de bromide door een primaire amine volgt de invoering van de zijketen. De twee-staps cyclus herhaald totdat de gewenste ketenlengte wordt bereikt. De koppeling efficiëntie van deze twee-staps cyclus van meer dan routinematig 98% en maakt de synthese van peptoids zo lang als 50 residuen. Zeer afstembare, nauwkeurige en chemisch verschillende sequenties zijn haalbaar met de submonomer methode als honderden van gemakkelijk beschikbare primaire amines kunnen direct worden opgenomen. Peptoids zijn in opkomst als een veelzijdig biomimetische materiaal voor nanobioscience onderzoek omdat hun synthetische flexibiliteit, robuustheid, en bestellen op atomair niveau. Het vouwen van een single-chain, amfifiele, informatieTIE-rijke polypeptoid tot een zeer geordende nanosheet werd onlangs aangetoond. Dit peptoïde is een 36-mer, dat bestaat uit slechts drie verschillende commercieel verkrijgbare monomeren: hydrofobe, kationische en anionische. De hydrofobe fenylethyl zijketens zijn begraven in de nanosheet kern terwijl de ionische amine-en carboxyl zijketens af te stemmen op de hydrofiele gezichten. De peptoïde nanosheets dienen als een potentieel platform voor het membraan mimetica, eiwit mimetica, apparaat fabricage, en sensoren. Methoden voor peptoïde synthese, bladvorming, en microscopie beeldvorming worden beschreven en bieden een eenvoudige methode om de toekomst peptoïde nanosheet ontwerpen mogelijk te maken.

Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Een eenvoudige en algemene handleiding peptoïde synthese methode waarbij basisuitrusting en de handel verkrijgbare reagentia wordt geschetst, zodat peptoids gemakkelijk worden gesynthetiseerd in de meeste laboratoria. De synthese, zuivering en karakterisatie van een amfifiele peptoïde 36mer wordt beschreven, evenals de zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets.

Vaste-fase-Submonomer Synthese van peptoïde polymeren en hun zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape Memory Polymeren voor actieve cel Cultuur

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

Fabricage van een dipool-geassisteerde Solid Phase Extraction Microchip voor Trace Metal Analysis in watermonsters

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

High-throughput Identificatie van bacteriën Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Synthese van gekationiseerde Magnetoferritin voor ultrasnelle magnetisatie van Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Moleculaire herkenning met Bio-mimetische Polymers op enkelwandige koolstof nanobuisjes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Synthese van ammoniak bij lage druk

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...