Name: solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Byoung-Chul Lee, Philip Choi og Samuel Ho for verdifull assistanse. Dette arbeidet ble utført ved Molekylær Foundry ved Lawrence Berkeley National Laboratory, som er støttet av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, av US Department of Energy under kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231 og Defense Threat Reduction etat under Contract No: IACRO-B0845281.

1. Solid-Phase Submonomer Synthesis of Polypeptoids Solid-fase syntese (SPS) er en vanlig teknikk som brukes til å syntetisere sekvens-spesifikk biopolymerer trinnvis, direkte på en inert solid-støtte som en polymer harpiks perle. Høy kobling avkastning og enkel overflødig reaktant fjerning er store fordeler av SPS. Etter en kobling reaksjon på harpiks, er overflødig reagenser bare drenert, og perlene er vasket å være klar for neste reaksjonen trinn. Etter den siste syntese reaksjonen, er den full-lengde oligomerer kløyvde fra harpiksen og løsningen fase materiale kan bli ytterligere undersøkt. Her tilpasser vi SPS prosedyre å generere sekvens-spesifikke peptoid polymerer. <ol><li> Setup: Alle trinn av håndboken peptoid syntesen kan gjennomføres på en engangs, polypropylen (PP) fritted kassett eller en fritted glass reaksjon fartøyet utstyrt med en 3-veis stoppekran. Utføre alle operasjoner i et avtrekksskap. For inkubasjoner i gLass fartøy eller plast patron, koble den ene armen til en nitrogentilførsel til å forsiktig boble løsningen for riktig blanding. Alternativt, for reaksjon inkubasjoner i disponibel kassetten, segl begge endene av tonerkassetten med caps og sted på en roterende shaker. Å drenere reaksjonsblandingene eller vasker, koble til huset vakuum via bortkastet felle. Fartøyet skal være fritted med en grov fritte. Siliconize glasset reaksjonen fartøy for å unngå perler fester seg til veggene i glasset fartøyet. Forbered en løsning på 5% dichlorodimethylsilane i dikloretan (v / v). Fyll en ren og tørr reaksjon fartøy til toppen med siliconizing løsning, la sitte i 30 minutter, deretter avløp. Vask fartøyet gang med DCE og deretter en gang med metanol. Den siliconizing løsningen kan gjenbrukes, så det skal lagres. Enten lufttørke eller rist av overflødig oppløsning og bake glass til den er tørr etter fjerning av stoppekran. Cool reaksjon fartøy før du legger harpiks. </li><li> Tilsett 100 mg (0,06 mmol) av Rink amid resynd til en fritted reaksjon fartøy. Swell harpiksen ved å tilsette 2 mL dimetylformamid (DMF). Agitere ved å riste eller boblende i 10 minutter. Drain løsningen ved vakuum å isolere de svulmet harpiks. </li><li> Tilsett 1 ml 20% 4-methylpiperidine i DMF (v / v) til deprotect den Fmoc gruppen. Agitere for 2 minutter og avløp. Gjenta med en 12 minutters inkubasjon. </li><li> Skyll harpiks ved å tilsette 2 mL av DMF, propaganderte for 15 sekunder, og drenering. Gjenta 3x. </li><li> Bromoacetylation: Tilsett 1 mL 0,6 M bromoacetic syre (0,6 mmol) i DMF og 86 mL av N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (0.93 tilsvarende, 0,56 mmol). Inkuber med myke bobler i 30 minutter, deretter avløp og skyll med 2 mL DMF (gjenta 4x). </li><li> Displacement: Tilsett 1 mL av 1-2 M amin i N-methylpyrrolidinone. Inkuber med boblende for 30-120 minutter, deretter avløp og skyll med DMF (4x 2 ml). </li><li> Fortsette å vokse peptoid kjeden ved å gjenta submonomer syklusen, steg 1,5 (bromoacetylation) og 1,6 (displacement). </li></ol><ol start="8"><li> Etter den siste forskyvning er gjort, skyll med 2 mL DMF (gjenta 4x), deretter 2 ml diklormetan (gjenta 3x). Cap og lagre reaksjonen skipet til cleavage. </li><li> Pause i syntese (valgfritt): For å pause under en peptoid syntese, avslutt forskyvning reaksjon og fortsett til trinn 1.8. For å fortsette å vokse de peptoid kjeden, starter syntesen av re-hevelse de tørkede harpiksen (trinn 1.2) og gjenta submonomer syklusen (steg 1.5 og 1.6). Harpiksen kan tørkes og lagres etter en eventuell forskyvning unntatt andre forskyvning fordi harpiksen-peptoid konjugat kan danne en syklisk diketopiperazine side produkt. </li><li> For flere samtidige synteser, er en solid-fase ekstraksjon vakuum manifold anbefales å maksimere effektiviteten. Peptoid syntese kan også automatiseres ved riktig programmering metoder i kommersielt tilgjengelig peptid synthesizere, som Aapptec 396 Apex, CEM Liberty mikrobølgeovn synthesizer og Protein TechnoLogies Inc. Prelude synthesizer. </li></ol> 2. Cleavage og Side-Chain Deprotection <ol><li> Overføre alle tørket harpiks til en 20 mL scintillation hetteglass. </li><li> Arbeider inne i en hette og bruk riktig personlig verneutstyr, tilsett 4 mL trifluoroacetic syre (TFA) cleavage cocktail 1 (f.eks 95% AQ. TFA, se diskusjonen) til scintillation hetteglass og lue tett. Rist i 10 minutter til 2 timer i romtemperatur (se diskusjon). </li><li> Samle TFA cleavage løsningen ved å filtrere harpiksen gjennom en engangs, PP fritted patron inn i en ny, pre-veide 20 ml scintillation hetteglass. En engangs, PP pipette er praktisk å overføre cleavage cocktail løsninger. </li><li> Tilsett 1 mL frisk cleavage cocktail å skylle harpiksen og samle eventuelle gjenværende peptoid. Gjenta 2x. </li><li> Fordampe TFA ved å blåse en svak strøm av nitrogen eller med en Biotage V10 fordamperen. </li><li> Oppløses igjen råolje i 6 mLav acetonitril / vann 1:1 (v / v) for HPLC. Freeze og lyophilize. Gjenta. </li><li> Record vekten av råolje produktet. Lagrer som et tørt pulver ved -20 ° C </li><li> Test cleavage (valgfritt): En test cleavage på 0,5% av harpiks kan utføres for å raskt bestemme renhet og masse syntetisert peptoid og om riktig cleavage forholdene var valgt. Test splittelsene er spesielt nyttige for å overvåke fremdriften av syntesen. </li></ol> 3. Karakterisering og rensing av Polypeptoid <ol><li> Gjennom en kombinasjon av analytiske HPLC, electrospray LC-MS, og / eller MALDI-TOF, fastsette renheten av råoljen produktet og om den ønskede molekylvekt er til stede. </li><li> Utarbeide en ~ 5-10 mg / ml løsning av den tørre peptoid pulver i vann med minimal acetonitril som trengs for løseligheten. Filter klar løsning av råolje peptoid produkt med 0,45 mikrometer sprøyte filter for å fjerne støv og partikler. </li><li> Analytisk HPLC og electrospray LC-MS: Utarbeide en ~ 20 mg / ml olje peptoid løsning. Filter 200 mL med 0,45 mikrometer filter og injisere 20 mL. </li><li> MALDI: Bland 1 mL av ~ 20 mg / ml peptoid med 1 mL matrise. Spot 1 mL på MALDI plate og la det lufttørke. Matrix og oppkjøp modus er avhengig sample (Fig. 5). </li><li> Rense råoljen peptoid blandingen med reverse-fase prep HPLC. Velg gradient og kolonne (C4 eller C18) basert på hydrofobisitet av polypeptoid. Kombiner renset fraksjoner, fryse, og lyophilize, som resulterer i en luftig hvitt pulver. Record vekten av det endelige produktet. </li><li> Dannelse av HCl salt (valgfritt): oppløses igjen den lyofiliserte pulveret i 100 mM HCl (aq.) med minimal acetonitril. Overføring til pre-veide hetteglass. Freeze og re-lyophilize. Gjenta 2x. Reweigh å bestemme massen av peptoid pulver. </li></ol> Fire. Peptoid Nanosheet Formation Denne delen describes protokollen å danne ark fra en enkelt-kjeden, sekvens spesifikk, amfifile 36-mer peptoid (Fig. 1). Etter peptoid tråd syntetiseres, renset, og lyofilisert som beskrevet ovenfor, er den resulterende hvite pulveret er oppløst i DMSO å lage en 2 mM stamløsning. <ol><li> Forbered 500 mL av 20 mM peptoid løsning i ark dannelsen buffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 8,0 pH i vann) i en 1 dram glass hetteglass. Først legger 445 mL av Milli-Q vann, 50 mL av 10x ark dannelse buffer, og vortex å blande. Deretter tilsett 5 mL av 2 mM peptoid stamløsning og forsiktig virvel løsning. Cap i hetteglass. </li><li> Ark er dannet av den milde agitasjon av fortynnede vandige peptoid løsning. Sakte vippe hetteglass fra horisontal posisjon til stående posisjon resultatene i ark. Lett risting gir også ark, men arkene tendens til å være mindre og med færre rette kanter. En mer grundig analyse av arket dannelsen mekanismen er reported separat. 2 </li><li> For mange av høy kvalitet ark, roter hetteglass om den horisontale aksen sakte (&lt;1 RPM) for en til tre dager. En passende Tekniske Resources RKVSD Rotamix tube rotator eller en tilpasset rocker kan utføre dette kontinuerlig. </li><li> Dialyse av Nanosheets (valgfritt): I enkelte programmer kan det være nødvendig å fjerne noen gratis peptoid kjettinger eller buffere / salter. Suge en Float-a-Lyzer 100 kD membran i ønsket buffer i 15 minutter. Load 500 mL peptoid sheet løsning i prøven kammeret. Sug i 500 mL av ønsket buffer, omrøring med en magnetisk røres bar ved 60 rpm. La dialyse ark for å fortsette i 4 timer. Hver time, utveksling med en frisk bestand av buffer løsning. </li></ol> 5. Fluorescens mikroskopi av Nanosheets <ol><li> Fluorescens bilder av nanosheets ble fotografert med Nile Red, en miljømessig sensitive fargestoffet som fluorescens intensiteten øker når den er lokalisert i hydrophobic miljøer (fig 2). </li><li> Tilsett 1 mL av 100 mM Nilen Red til 100 mL av nanosheet løsningen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 mM av Nilen Red. </li><li> Lag en 1% agarose løsning i varmt vann og hell i en plast petriskål. Sørg for at agarose løsningen er ca 1 / 8 tommer tykk og la løsningen kjøle uforstyrret på et flatt underlag. Etter agarose sett, bruk en slikkepott til å kutte og overføre 1 cm x 1 cm kvadrater til en glass-slide. </li><li> Å samle ark i samme plan, punkt 1 mL av arket løsning på stykke agarose. La agarose å absorbere buffer for 2 minutter, slik at arkene på overflaten. Bilde innen 15 minutter, ellers agarose vil begynne å deformere grunn av dehydrering. </li><li> Til bilde ark i løsning, last 15 mL inne i et 20 mm diameter 0,12 mm pakning på et glass slide. Dekk med et dekkglass. Hvis papiret er rett og slett klemt mellom en glass-slide og dekkglass uten pakning, mange ark will skjær og tilsynelatende mindre fordamping vil føre arkene å stadig flytte. </li><li> Bilde ark henhold epifluorescence belysning (f.eks en Olympus IX81 invertert mikroskop utstyrt med Andor iXonEM + EMCCD spektra med en Texas rødt filter). </li></ol> Seks. Scanning Elektronmikroskopi (SEM) av Nanosheets <ol><li> Plasma etch av silikon substrat (valgfritt): Den silisium sjetonger er plasma etset til hjelp i adsorpsjon av ark. Plasser silisium sjetonger i vakuum kammeret av en plasma renere (f.eks harrick Plasma Cleaner / Sterilizer PDC-32G). Pump ned til 200 mTorr og sett RF spolen til 18W (høy innstilling for PDC-32G). Etch i 2 minutter. </li><li> Drop 20 mL av peptoid ark løsning på en plasma-behandlet silisium substrat. La det sitte i 3 minutter. Fjern overflødig løsning med tuppen av Kim-tørk. Pipetter 20 mL av vann på overflaten og fjerne overflødig oppløsning igjen for å fjerne buffer og salter. Gjenta 4x. </li><li> Alternativt dialyze den peptoid arket løsninger mot vann for å fjerne buffer og salt. Drop 20 mL av dialyzed arket løsning på plasma-behandlet silisium underlag. Lufttørke prøven. </li><li> Bilde ark med SEM (f.eks Zeiss Gemini Ultra-55 Analytisk Scanning Electron Microscope) med en in-objektiv detektor og i bjelken energier mellom 1 kV og 5 kV (Fig. 3). </li></ol> 7. Safety Notes: <ol><li> Dimethylformamide og Dichloromethane er mistenkt kreftfremkallende. </li><li> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine og bromoacetic syre er farlig for hud, øyne og luftveier. De bør brukes i hette med forsiktighet. Det kan være giftig ved innånding eller absorberes gjennom huden, og eksponering kan føre til sensibilisering. Tom emballasje inneholder produktrester (væske / damp) og bør skylles grundig før du fjerner dem fra panseret. </li><li> TFA er en sterk syre, og er ekstremt ødeleggende for de øvre luftveier, øyne oghud. TFA er også flyktig-holde konsentrerte løsninger av TFA i panseret til enhver tid å unngå respiratoriske skade. Bruk riktig verneutstyr, og forsiktighet ved håndtering av løsninger av TFA. Skift hansker omgående hvis de kommer i kontakt med TFA, og umiddelbart rydde opp søl. </li></ol> 8. Representant Resultater: Denne delen beskriver syntese, karakterisering, og rensing av en sekvens-spesifikke 36-mer peptoid kjede som foldes inn i en svært bestilt nanosheet 3 (Fig. 1). Blokken-charge peptoid H-[Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 ble syntetisert på 100 mg av Rink amid harpiks. A 2 M amin-løsning ble brukt for alt fortrengningsreaksjoner, som ble gjennomført i 60 minutter for rester 1-18 og 120 minutter for rester 19-36. t-Butyl beta-alanin HCl ble konvertert til fri base (se omtale), mens phenethylamine og Boc-etylendiamintartrat ble begge brukt directly. Harpiksen var kløyvde med 95% TFA, 2,5% triispropylsilane, 2,5% vann i 2 timer. TFA var fordampet og de resulterende tyktflytende olje (~ 180 mg) ble re-oppløst i 6 ml acetonitril: vann 1:1 (v / v). Produkt renhet (Fig. 4) og tilstedeværelse av produktet massen ble bekreftet av fra analytiske RP-HPLC (30-80% acetonitril i vann gradient, både som inneholder 0,1% (v / v) TFA, på 1 ml / min over 30 minutter ved 60 ° C med en C18, 5 mikrometer, 50 x 2 mm kolonne) og MALDI (Fig. 5). Rensing med revers fase HPLC på en Vydac C18 kolonne (10 mm, 22 mm x 250 mm) fortsatte, med en stigning på 30-60% acetonitril i vann med 0,1% TFA over 60 minutter ved 10 ml / min. Kolonnen var lastet med 60 mg av råolje produkt for hver kromatografisk løpe. Den rensede fraksjoner ble kombinert basert på renhet fra analytiske RP-HPLC (Fig. 4) og lyofilisert å gi ~ 80 mg av et luftig hvitt pulver. Renset blokk-charge peptoid molekylærvekt ble bekreftet av MALDI. 1 mL av 100 mM renset peptoid i acetonitril: vann 1:1 (v / v) ble blandet med 1 mL av matrix (5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic syre i acetonitril: vann 01:01 v / v og 0,1% TFA) og 1 mL ble oppdaget på MALDI plate. Etter at prøven lufttørket, ble det plassert i Applied Biosystem / MDS SCIEX 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer. Denne innsamlingen og prosesseringen moduser var lineær lav masse. Den beregnede vekten ble lagt inn i målrettet masse å automatisk justere for forsinkelsen. Laseren Intensiteten ble satt til 3400. Den observerte masse, 4981.2, fyrstikker tett til den beregnede massen av 4981.74. Den lyofilisert renset pulver ble oppløst i DMSO å lage en 2 mM stamløsning, som kan lagres ved 4 ° C. Ark ble utarbeidet av nevnte protokoll og avbildes med fluorescens optisk mikroskopi og SEM (Fig. 2 og 3). En rekke former med funksjonen størrelser opp til 300 mikrometer er observert, og notably, rette kanter er fremtredende. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" /> Figur 1 Sekvens av blokk-lade peptoid H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. En single-kjeden, blokk ladning, amfifile polypeptoid 36-mer selv samler inn svært bestilt, to-dimensjonale nanosheets 3. Den beregnede molekylvekt er 4981,74. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" /> Figur 2. Fluorescens mikroskopi bilder av peptoid nanosheets. Ark ble dannet fra en 20 mM peptoid løsning i 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 8,0 pH. Arkene ble fotografert på agarose med 1μM Nilen Red. Scale barer er 100 mikrometer. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" /> Figur 3. Scanning elektronmikroskopi bilderav peptoid nanosheets. Ark ble dannet fra en 20 mM peptoid løsning i 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 8,0 pH. Scale barer er 5 mikrometer. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" /> Figur 4 Analytisk revers fase HPLC spor av H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Den rå og renset analytisk HPLC trace (30-80% stigning på 1 ml / min over 30 minutter ved 60 ° C med en C18, 5 mikrometer, 50 x 2 mm kolonne) av råolje og renset blokk-lade peptoid H-[ Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 er vist. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" /> Figur 5 MALDI-TOF masse spektroskopi spor av H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Den observerte masse, 4981.2, er i nær enighet til beregnet masse, 4981,74.

<ol>
	<li>King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cleavage+method+which+minimizes+side+reactions+following+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis.">A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).</li><li>Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaken,+not+stirred:+Collapsing+a+peptoid+monolayer+to+produce+free-floating,+stable+nanosheets.">Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets.</a> J. Am. Chem. Soc. , (2011).</li><li>Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+single-chain,+information-rich+polypeptoid+sequence+into+a+highly-ordered+nanosheet.">Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet.</a> Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+multistep+synthesis+of+a+bioactive+peptidomimetic+oligomer+for+the+undergraduate+laboratory.">Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory.</a> J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).</li><li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+peptoids:+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function.">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).</li><li>Zuckermann, R. N., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+as+potential+therapeutics.">Peptoids as potential therapeutics.</a> Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).</li><li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+that+mimic+the+structure,+function+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides.">Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> , 105-2794 (2008).</li><li>Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+method+for+detection+of+amyloidogenic+misfolded+proteins.">A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins.</a> Biochem. 50, 4322-4329 (2011).</li><li>Huang, C. -. Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipitoids+-+novel+cationic+lipids+for+cellular+delivery+of+plasmid+DNA+in+vitro.">Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro.</a> Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).</li><li>Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Br&#228;se, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoidic+amino-+and+guanidinium-carrier+systems:+Targeted+drug+delivery+into+the+cell+cytosol+or+the+nucleus.">Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li><li>Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+a+biomimetic+diblock+copolypeptoid+into+homochiral+super+helices.">Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).</li><li>Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+ultra-thin+two-dimensional+crystals+from+sequence-specific+peptoid+polymers.">Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers.</a> Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+synthesis+of+artificial+proteins:+The+Discovery+of+an+amphiphilic+helical+peptoid+assembly.">Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly.</a> Chemistry &#38; Biology. 9, 647-654 (2002).</li><li>Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combinatorial+approach+to+the+discovery+of+efficient+cationic+peptoid+reagents+for+gene+delivery.">A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).</li><li>Mora, P. u. i. g., Masip, I. s. a. b. e. l., Cort&#233;s, N. u. r. i. a., Marquina, R. e. g. i. n. a., Merino, R. a. m. &. #. 2. 4. 3. ;. n., Merino, J. e. s. &. #. 2. 5. 0. ;. s., Carbonell, T. e. r. e. s. a., Mingarro, I. s. m. a. e. l., Messeguer, A. n. g. e. l., P&#233;rez-Pay&#225;, E. n. r. i. q. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+from+a+positional+scanning+peptoid+library+of+in+vivo+active+compounds+that+neutralize+bacterial+endotoxins.">Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins.</a> J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).</li><li>Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+(N-substituted)glycine+peptoid+Library.">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li><li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library.">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-(substituted)glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+(&amp;alpha;+peptoids)+and+derivatives.">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&amp;alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis.">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Søknader og betydning Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for peptoid syntese og vannholdige selv-montering av peptoids inn nanosheets. De fleste laboratorier er lett stand til å syntetisere peptoids fordi billige materialer, grunnleggende kompetanse og enkle teknikker er utnyttet fire. Likeledes krever selv-montering av ultra-tynn, svært bestilte nanosheets bare gjentatt tilting et hetteglass med en fortynnet vandig peptoid løsning 2. Peptoids er lovende materiale for biomedisinsk og nanovitenskap forskning fordi de er robuste og synthetically fleksibel ennå sekvens-spesifikke og svært tunbare 5. Peptoids har vist biologisk aktivitet (legemiddelselskap 6,7, diagnostikk 8, intracellulære levering 9-10) og folde inn hierarkiske nanostrukturer 3, 11-14. På grunn av sin modulære syntese, kombinatorisk peptoid librVæren 15-19 kan lett syntetiseres og screenes for en bred serie av aktiviteter eller eiendom. Spesielt nanosheets tjene som en potensiell plattform for to-dimensjonal visning stillasene, membran mimetics, biologiske sensorer, protein mimetics og enhet fabrikasjon. Med praktisk talt uuttømmelige forskjellige sekvenser mulig, er rike peptoid forskning raskt ekspanderende. Variabler i fast-fase submonomer syntese av polypeptoids På grunn av muligheten til å velge fra en utrolig stor og mangfoldig alfabet av monomerer 20, må submonomer metode sporadiske modifikasjoner for tilfeller hvor øke koblingen effektiviteten av hvert trinn vil forbedre den totale produktet yield. Inkorporering av ubeskyttet heterosykliske sidekjeder krever bruk av chloroacetic syre i stedet for bromoacetic syre 21. Utvidet displacement ganger og høyereamin konsentrasjoner er vanligvis ansatt etter ca 20 koplinger for lang peptoid sekvenser eller mindre nucleophilic aminer. Oppvarming reaksjonen fartøy til 35 ° C, ved hjelp av en vann-Jacketed reaksjon fartøy, bidrar til å drive reaksjonen. For svært flyktige aminer som isopropylamine, må man sørge for å unngå fordampning. Aminer i form av en HCl salt, som for eksempel t-butyl beta-alanin HCl, må være fri-baserte før de blir introdusert i flukt reaksjon. Dette kan oppnås ved å løse eller opphenging av amin i DCM (~ 5g amine/25 ml DCM), og nøytralisere med en ekvimolare løsning av vandig natriumhydroksid i en skilletrakt. Den DCM laget er samlet og vandig laget er vasket med ekstra DCM. Den kombinerte DCM lagene er tørket i løpet natriumsulfat og filtrert inn i en pre-veid rund bunn kolbe. Fjern løsemiddel med roterende fordampning å gi en olje, og registrere produktet vekt. Durinsg spalting trinn, TFA spalting cocktail og cleavage tid er avhengig av antall og variasjon av beskytte grupper brukes. Retningslinjer for cleavage cocktails ligner på tradisjonelle peptid deprotection splittelsene 1. Vanligvis er 10 minutter inkubasjoner kreves for sekvenser uten å beskytte grupper eller sekvenser med få svært syrelabil beskytte grupper (f.eks BOC, trityl). To timers inkubasjoner er anbefalt for sekvenser med vanskeligere beskytte grupper (f.eks t-butyl ester, Mtr, PBF) eller sekvenser med mange beskytte grupper for å sikre full deprotection av hver kjede. Crude peptoid produkter vil vanligvis løse seg opp i acetonitril: vann 1:1 (v / v), men høyere acetonitril proporsjonene er felles med sidekjeder med høyt generelt hydrofobisitet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Dimethylformamide </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99 +% </td></tr><tr><td> N-methylpyrrolidinone </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Bromoacetic Acid </td><td> Acros Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4-Methylpiperidine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide </td><td> Chem-Impex </td><td> 001100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Diklormetan </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS karakter </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic syre </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 233 781 -10G </td><td> For TFA cleavage </td></tr><tr><td> 1,2-dikloretan </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> For siliconization av glass reaksjon fartøy </td></tr><tr><td> Phenethylamine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 407267-100ML </td><td> &gt; 99,5% hydrofobe side-chain amin </td></tr><tr><td> Boc-etylendiamintartrat </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Kationiske side-chain amin </td></tr><tr><td> t-Butyl beta-alanin HCl </td><td> Chem-Impex International </td><td> 04407 </td><td> Anioniske side-chain amin </td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic syre </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> For MALDI matrise </td></tr><tr><td> Nile Red </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 19123-10mg </td><td> For fluorescens Imaging </td></tr><tr><td> Dichlorodimethylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 80 430-500G-F </td><td> For siliconization av glass reaksjon fartøy </td></tr><tr><td> Engangs PP fritted cartmøne </td><td> Applied Separasjoner </td><td> 2416 </td><td> 6 mL polypropylen patron med 20 mm PE fritte </td></tr><tr><td> Engangs 3-veis luer adapter </td><td> Cole Parmer </td><td> 31200-80 </td><td> Stoppekran for engangs manuell syntese reaksjonen fartøy </td></tr><tr><td> Luer Lock ring </td><td> Cole Parmer </td><td> 45503-19 </td><td> ¼ &quot;passer for disponibel manuell syntese reaksjonen fartøy </td></tr><tr><td> Fittings Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45500-20 </td><td> ¼ &quot;passer for disponibel manuell syntese reaksjonen fartøy </td></tr><tr><td> Engangs PP pipets </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> For TFA overføringer </td></tr><tr><td> Luer lock plastsprøyte </td><td> National Scientific </td><td> S7515-5 </td><td> 6 ml sprøyter </td></tr><tr><td> En dram glass hetteglass </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Med fenoliske støpt skrukork med polyvinyl-faced masse liner </td></tr><tr><td> 20 ml scintillation hetteglass </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Med festet PP cap og masse folie liner </td></tr><tr><td> Secure-Seal lim spacer </td><td> Invitrogen </td><td> S-24 736 </td><td> For fluorescens bildebehandling </td></tr><tr><td> Glass lysbilder </td><td> Elektronmikroskopi Sciences </td><td> 63411 </td><td> For fluorescens bildebehandling </td></tr><tr><td> Cover slip </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> For fluorescens bildebehandling </td></tr><tr><td> 4 &quot;Silicon wafer </td><td> Ted Pella </td><td> 16007 </td><td> Pre-terningene i 5x7 mm chips </td></tr><tr><td> 0,45 filter </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> For HPLC. PTFE membran </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> BD </td><td> 212272 </td><td> For fluorescens bildebehandling </td></tr><tr><td> SPE Vacuum Manifold </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 57044 </td><td> Eksempel på SPE vakuum manifold </td></tr><tr><td> Fritted glass fartøy </td><td> Ace glass </td><td> 6402-12 </td><td> Porøsitet Cfritte </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Sterilizer </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Eksempel på plasma renere å forberede silisium sjetonger for SEM </td></tr></tbody></table>

solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets

Peptoids er en ny klasse av biomimetic, ikke-naturlige, sekvens-spesifikke heteropolymers som motstår proteolyse, utstillingsområde potent biologisk aktivitet, og vend inn i høyere orden nanostrukturer. Strukturelt lik peptider, peptoids er poly N-substituerte Glycines, der sidekjeder er festet til nitrogen enn alfa-karbon. Deres lette syntese og strukturelle mangfoldet gjør testing av grunnleggende design prinsipper for å drive de novo design og prosjektering av nye biologisk aktive og nanostrukturerte materialer. Her er en enkel manuell peptoid syntese protokoll presenterte som gjør at syntesen av langkjedete polypeptoids (opptil 50mers) i utmerket avkastning. Kun grunnleggende utstyr, enkle teknikker (f.eks flytende transfer, filtrering) og kommersielt tilgjengelig reagenser er nødvendig, noe som gjør peptoids et tilgjengelig tillegg til mange forskere &#39;verktøysett. Den peptoid backbone er dyrket en monomer gangen vbl.a. submonomer metode som består av en to-trinns monomer tillegg syklus: acylation og forskyvning. Først bromoacetic syre aktivert in situ med N, acylates N&#39;-diisopropylcarbodiimide en harpiks-bundet sekundære amin. Sekund, nucleophilic forskyvning av bromide ved en primær amin følger å introdusere siden kjeden. De to-trinns syklus er iterated til ønsket kjedelengden er nådd. Koblingen effektiviteten av denne to-trinns syklus overstiger rutinemessig 98% og gjør syntesen av peptoids så lenge som 50 rester. Meget tunbare, presis og kjemisk diverse sekvenser er oppnåelig med submonomer metoden som hundrevis av lett tilgjengelige primære aminer kan være direkte innarbeidet. Peptoids er fremstår som en allsidig biomimetic materiale for nanobioscience forskning på grunn av deres syntetiske fleksibilitet, robusthet, og bestilling på atomnivå. Folding av en enkelt-kjede, amfifile, informasjon-rik polypeptoid inn i en svært bestilte nanosheet ble nylig demonstrert. Dette peptoid er en 36-mer som består av bare tre forskjellige kommersielt tilgjengelige monomerer: hydrofobe, kationiske og anioniske. Den hydrofobe Phenylethyl sidekjeder er gravlagt i nanosheet kjernen mens ionisk amin og carboxyl sidekjeder justere på hydrofile ansikter. Den peptoid nanosheets tjene som en potensiell plattform for membran mimetics, protein mimetics, enhet fabrikasjon, og sensorer. Metoder for peptoid syntese, ark formasjon, og mikroskopi bildebehandling er beskrevet og gir en enkel metode for å muliggjøre fremtidig peptoid nanosheet design.

Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

En enkel og generell manuell peptoid syntese metoden involverer basisutstyr og kommersielt tilgjengelige reagenser er skissert, slik at peptoids å være lett syntetiseres i de fleste laboratorier. Syntese, rensing og karakterisering av en amfifile peptoid 36mer er beskrevet, samt dens selv-montering i svært bestilt nanosheets.

Solid-fase Submonomer syntese av Peptoid Polymers og deres Self-Assembly inn Svært Bestilt Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Regissert Cellular Self-Assembly å dikte Cell-Avledet Tissue Rings for Biomekaniske Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk Kontroll av levende celler elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

Fabrikasjon av en dipol-assistert fastfaseekstrahering Microchip for Trace Metal analyse i vannprøver

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntese av gull nanopartikkel Integrated Photo-responsive liposomer og måling av deres av mikro Kavitasjon på Pulse Laser Eksitasjon

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Høy throughput identifisering av bakterier Repellent Polymers for medisinsk utstyr

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Fabrikasjon nedbrytbar Thermoresponsive Hydrogels på flere lengde skalaer via reaktive ekstrudering, Microfluidics, selvstendig montering, og Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntese av kationiserte Magnetoferritin for Ultra-rask Magnetization Celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molecular Recognition med Bio-mimetiske Polymers på enkelt Walled karbonnanorør

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Ammoniakk syntese med lavt trykk

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...