Name: solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

Författarna vill tacka Byoung-Chul Lee, Philip Choi och Samuel Ho för värdefull hjälp. Detta arbete utfördes på molekylär Gjuteri vid Lawrence Berkeley National Laboratory, som stöds av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, av US Department of Energy i Kontrakt nr DE-AC02-05CH11231 och Defense Threat Reduction byrån enligt avtal nr: IACRO-B0845281.

1. Fast fas Submonomer Syntes av Polypeptoids Fast fas syntes (SPS) är en vanlig teknik som används för att syntetisera sekvensspecifika biopolymerer stegvis, direkt på ett inert fast stöd, t.ex. ett polymerharts pärla. Hög koppling avkastning och enkel överskott reaktant borttagning finns stora fördelar av SPS. Efter en koppling reaktion på harts, finns ett överskott av reagens enkelt tömmas och pärlor tvättas för att vara redo för nästa reaktionen steg. Efter den sista syntes reaktion, är de i full längd oligomerer klyvs från kåda och lösningen fas material kan studeras ytterligare. Här anpassar vi SPS förfarande för att generera sekvensspecifika peptoid polymerer. <ol><li> Inställningar: Alla steg i manualen peptoid syntesen kan utföras i en disponibel, polypropen (PP) porös patron eller porös glas reaktionskärl utrustad med en 3-vägs kranen. Utför all verksamhet i ett dragskåp. För inkubationer i GLASS fartyg eller plast patronen, anslut en arm till en kvävetillförseln till försiktigt bubbla lösningen för korrekt blandning. Alternativt, för reaktionen inkubationer i disponibel patron, förslut båda ändarna av kassetten med lock och lägg på en rotationsskak. Rinna reaktion blandningar eller tvättar, ansluter till huset vakuum via en avfallet fälla. Fartyget ska vara porös med grov frit. Siliconize fartyget glaset reaktion för att undvika kulorna fastnar väggarna i glaskärl. Bered en lösning av 5% dichlorodimethylsilane i dikloretan (v / v). Fyll en ren och torr reaktionskärlet till toppen med siliconizing lösning, låt sitta i 30 minuter, låt rinna av. Tvätta kärlet en gång med DCE och sedan en gång med metanol. Den siliconizing Lösningen kan återanvändas, så det ska sparas. Antingen lufttorka eller skaka av överflödig lösning och baka glas tills det är torrt efter borttagning kranen. Cool reaktionskärl innan du lägger harts. </li><li> Tillsätt 100 mg (0,06 mmol) Rink amid resynd att en porös reaktionskärl. Swell hartsen genom att tillsätta 2 ml dimetylformamid (DMF). Skaka genom att skaka eller genomströmning i 10 minuter. Töm lösning genom vakuum för att isolera svällde harts. </li><li> Tillsätt 1 ml 20% 4-methylpiperidine i DMF (v / v) till deprotect de Fmoc gruppen. Rör i 2 minuter och avlopp. Upprepa med en 12 minuters inkubation. </li><li> Skölj hartset genom att tillsätta 2 mL av DMF, agitera i 15 sekunder, och dränering. Upprepa 3x. </li><li> Bromoacetylation: Tillsätt 1 mL 0,6 M bromoacetic syra (0,6 mmol) i DMF och 86 mikroliter av N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (0,93 motsvarande 0,56 mmol). Inkubera med mjuka bubblande i 30 minuter, låt rinna av och skölj med 2 ml DMF (upprepa 4x). </li><li> Deplacement: Tillsätt 1 mL 1-2 m amin i N-methylpyrrolidinone. Inkubera med bubblande i 30-120 minuter, låt rinna av och skölj med DMF (4x 2 ml). </li><li> Fortsätta att växa peptoid kedjan genom att upprepa submonomer cykeln, steg 1,5 (bromoacetylation) och 1,6 (displacement). </li></ol><ol start="8"><li> Efter den sista förskjutning sker, skölj med 2 ml DMF (upprepa 4x), sedan 2 ml diklormetan (upprepa 3x). Cap och lagra reaktionskärlet tills klyvning. </li><li> Paus i syntesen (valfritt): För att pausa under en peptoid syntes, avsluta förskjutningen reaktionen och fortsätt till steg 1,8. För att fortsätta växa peptoid kedjan, starta om syntesen genom att åter svullnad den torkade kådan (steg 1,2) och upprepa submonomer cykeln (steg 1,5 och 1,6). Hartset kan torkas och lagras efter någon förskjutning förutom den 2: a förskjutning eftersom harts-peptoid konjugat kan bilda en cyklisk produkt diketopiperazin sida. </li><li> För flera samtidiga synteser, är en fast-fas extraktion vakuum grenrör rekommenderas att maximera effektiviteten. Peptoid syntes kan också automatiseras korrekt programmering metoder i kommersiellt tillgängliga peptid syntar, såsom Aapptec Apex 396, CEM Liberty mikrovågsugn synt och Techno ProteinLogies Inc. Prelude synthesizer. </li></ol> 2. Klyvning och sidokedjan Deprotection <ol><li> Överför alla av torkad kåda till en 20 ml scintillation injektionsflaska av glas. </li><li> Att arbeta i en huva och använder rätt personlig skyddsutrustning, Tillsätt 4 ml av trifluorättiksyra (TFA) klyvning cocktail 1 (t.ex. 95% aq. TFA, se diskussion) till scintillation glasflaska och skruva fast den. Skaka om under 10 minuter till 2 timmar vid rumstemperatur (se diskussion). </li><li> Samla TFA klyvning lösningen genom att filtrera hartset genom en disponibel, PP porös cylinderampullen med en ny, pre-vägde 20 ml scintillation injektionsflaska av glas. En disponibel, PP pipett är bekvämt att överföra lösningar klyvning cocktail. </li><li> Tillsätt 1 ml färsk klyvning cocktail att skölja harts och samla alla rester peptoid. Upprepa 2x. </li><li> Indunsta TFA genom att blåsa en mjuk ström av kväve eller genom att använda en Biotage V10 förångare. </li><li> Lös åter upp råolja i 6 mlacetonitril / vatten 1:1 (v / v) för HPLC. Frys och lyophilize. Upprepa. </li><li> Notera vikten av den råa produkten. Lagra som ett torrt pulver vid -20 ° C </li><li> Test klyvning (valfritt): Ett test klyvning på 0,5% av harts kan utföras för att snabbt bestämma renhet och massa syntetiserade peptoid och om rätt klyvning villkor valdes. Testa klyftor är särskilt användbara för att övervaka utvecklingen av syntes. </li></ol> 3. Karakterisering och rening av Polypeptoid <ol><li> Genom en kombination av analytisk HPLC, elektrospray LC-MS, och / eller MALDI-TOF, bestämma renhet av den råa produkten och om de önskade molekylvikt är närvarande. </li><li> Förbered en ~ 50-10 mg / ml lösning av den torra peptoid pulver i vatten med minimal acetonitril som behövs för löslighet. Filtrera klar lösning av råolja peptoid med 0,45 ìm spruta filter för att avlägsna damm och partiklar. </li><li> Analytisk HPLC och elektrospray LC-MS: Förbered en ~ 20 mikrogram / ​​ml rå peptoid lösning. Filter 200 mikroliter med 0,45 ìm filter och injicera 20 mikroliter. </li><li> MALDI: Blanda 1 mikroliter av ~ 20 mg / ml peptoid med 1 mikroliter matris. Spot 1 mikroliter på MALDI tallrik och låt lufttorka. Matrix och förvärv läge är beroende av prov (bild 5). </li><li> Rena råa peptoid blandningen med omvänd fas prep HPLC. Välj lutning och kolumn (C4 eller C18) baserat på hydrofobicitet polypeptoid. Kombinera renade fraktioner, frysa och lyophilize, vilket resulterar i ett fluffigt vitt pulver. Notera vikten av den slutliga produkten. </li><li> Bildning av klorid (tillval): Lös upp det frystorkade pulvret i 100 mM HCl (destillerat) med minimal acetonitril. Överföring i förväg vägd flaskan. Freeze och re-lyophilize. Upprepa 2x. Väg att bestämma massan av peptoid pulver. </li></ol> 4. Peptoid Nanosheet Formation Detta avsnitt describes protokollet att bilda ark från en enda kedja, sekvens specifika, amfifila 36-mer peptoid (Fig. 1). Efter peptoid strand syntetiseras, renat och frystorkade enligt ovan, är det vita pulvret löst i DMSO att göra en 2-lösning mM lager. <ol><li> Förbered 500 mikroliter av 20 mikroM peptoid lösning i plåt bildning buffert (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 i vatten) i en 1 dram glasflaska. Lägg först till 445 mikroliter av Milli-Q vatten, 50 mikroliter av 10x plåt bildning buffert, och skaka för att blanda. Lägg sedan till 5 mikroliter av 2 mm peptoid stamlösning och snurra försiktigt lösning. Cap på glasflaska. </li><li> Lakan bildas genom försiktig omrörning i utspädda vattenlösningar peptoid lösning. Långsamt luta glasflaska från horisontellt läge till upprätt läge resulterar i ark. Försiktig skakning ger också blad, men bladen tenderar att vara mindre och med färre raka kanter. En mer grundlig analys av arket bildas mekanismen är reported separat. 2 </li><li> För många högkvalitativa skivor, rotera glasflaskor om den horisontella axeln långsamt (&lt;1 rpm) för en till tre dagar. En lämpliga tekniska resurser RKVSD ROTAMIX rör rotator eller en skräddarsydd rocker kan utföra detta kontinuerligt. </li><li> Dialys av Nanosheets (frivilligt): I vissa applikationer kan det vara nödvändigt att undanröja alla fria peptoid kedjor eller buffertar / salter. Blöt en Float-a-analysatorn 100 kD membran i önskad buffert i 15 minuter. Ladda 500 mikroliter lösning peptoid ark i provet kammaren. Blötlägg i 500 ml önskad buffert, omrörning med en magnetisk omrörare vid 60 rpm. Tillåt dialys ark för att fortsätta i 4 timmar. Varje timme, utbyte med ett nytt lager av buffertlösning. </li></ol> 5. Fluorescensmikroskopi av Nanosheets <ol><li> Fluorescens bilder av nanosheets var avbildade med Nilen Röd, ett miljövänligt färgämne vars fluorescensintensiteten ökar när den är lokaliserad i hydrophobic miljöer (Fig. 2). </li><li> Tillsätt 1 mikroliter av 100 mikroM Nilen Röd till 100 mikroliter av nanosheet lösning för att erhålla en slutlig koncentration av 1 mikrometer i Nilen Röd. </li><li> Gör en 1% agaroslösningen i hett vatten och häll i en plast petriskål. Se till att agaroslösningen är ca 1 / 8 tum tjock och låt lösningen svalna ostört på en plan yta. Efter agarosen apparater, använd en spatel för att klippa och överföra 1 cm x 1 cm rutor på en glasskiva. </li><li> Att samla in blad i samma plan, plats 1 mikroliter av plåt lösningen på bit agarosen. Låt agarosen att absorbera buffert för 2 minuter, lämnar lakan på ytan. Bild inom 15 minuter, annars agarosen börjar deformeras på grund av uttorkning. </li><li> Att bilden blad i lösning, belastning 15 mikroliter inuti en 20 mm diameter 0,12 mm packning på en glasplatta. Täck med ett täckglas. Om bladen är helt enkelt inklämt mellan en glasplatta och täckglas utan packning, många blad will skjuvning och den till synes mindre avdunstningen gör att lakan att ständigt flytta. </li><li> Bild ark i epifluorescence belysning (t.ex. en Olympus IX81 inverterat mikroskop utrustat med en Andor iXonEM + EMCCD spektra med en Texas rött filter). </li></ol> 6. Svepelektronmikroskop (SEM) av Nanosheets <ol><li> Plasma etch av silikon substrat (valfritt): Den kisel chips är plasma etsas till stöd i adsorption av ark. Placera kisel chips i vakuumkammare för en plasma-renare (t.ex. Harrick Plasma Cleaner / Sterilizer PDC-32G). Pump ner till 200 mTorr och ställa in RF-spole till 18W (hög inställning för PDC-32G). Etch i 2 minuter. </li><li> Drop 20 mikroliter av peptoid blad lösning på en plasma-behandlade kiselsubstratet. Låt sitta i 3 minuter. Ta bort överflödig lösning med spetsen av Kim-torka. Pipettera 20 mikroliter vatten på ytan och avlägsna överflödig lösning igen för att ta bort buffert och salter. Upprepa 4x. </li><li> Alternativt, slåyze den peptoid arket lösningar mot vatten för att avlägsna buffert och salt. Drop 20 mikroliter av dialyseras plåt lösning på plasma-behandlade kisel substrat. Lufttorka provet. </li><li> Bild ark med SEM (t ex Zeiss Gemini Ultra-55 Analytisk svepelektronmikroskop) med en i-lins detektorn och på balk energier mellan 1 kV och 5 kV (Fig. 3). </li></ol> 7. Säkerhetsanvisningar: <ol><li> Dimetylformamid och Diklormetan är skäligen misstänkt cancerframkallande. </li><li> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine och bromoacetic syra är farliga för hud, ögon och andningsorgan. De ska användas i huven med omsorg. Det kan vara giftig att inandas eller absorberas genom huden, och exponering kan leda till allergi. Tomma behållare har kvar produktrester (vätska / ånga) och bör sköljas innan du tar bort dem från huven. </li><li> TFA är en stark syra, och är extremt skadligt för de övre luftvägarna, ögonen ochhud. TFA är också flyktiga hålla koncentrerade lösningar av TFA i huven hela tiden för att undvika respiratorisk skador. Använd rätt skyddsutrustning, och försiktighet vid hantering av lösningar av TFA. Byt handskar omedelbart om de kommer i kontakt med TFA, och genast städa upp eventuella spill. </li></ol> 8. Representativa resultat: Detta avsnitt beskriver de syntes, karakterisering, och rening av sekvensspecifika 36-mer peptoid kedja som fälls in i en mycket beställde nanosheet 3 (Fig. 1). Blocket-avgiften peptoid H-[Nae-Npe] 9 - [IOU-Npe] 9-NH 2 sammanställdes på 100 mg av Rink amid harts. En 2 M amin lösningen för alla förskjutning reaktioner, som genomfördes i 60 minuter för rester 1-18 och 120 minuter för rester 19-36. t-Butyl beta-alanin HCl konverterades till fri bas (se diskussion) medan phenethylamine och BOC-etylendiamin var båda användes directly. Hartset var klyvs med 95% TFA, 2,5% triispropylsilane, 2,5% vatten i 2 timmar. TFA har avdunstat och resulterande trögflytande olja (~ 180 mg) löses upp i 6 ml acetonitril: vatten 1:1 (v / v). Produkt renhet (bild 4) och närvaro av produkten massan bekräftades av från analytisk RP-HPLC (30-80% acetonitril i vatten lutning, som båda innehåller 0,1% (v / v) TFA, vid 1 ml / min under 30 minuter vid 60 ° C med en C18, 5 ìm, 50 x 2 mm spalt) och MALDI (bild 5). Rening med omvänd fas HPLC på en Vydac C18 kolonn (10 ìm, 22 mm x 250 mm) fortsatte, med en lutning på 30-60% acetonitril i vatten med 0,1% TFA under 60 minuter vid 10 ml / min. Kolumnen var lastad med 60 mg av råolja produkt för varje provserie. Det renade fraktioner kombinerades baseras på renhet från analytiska RP-HPLC (bild 4) och frystorkat för att ge ~ 80 mg en fluffig vitt pulver. Renat block-avgiften peptoid molekyläravikt bekräftades av MALDI. 1 mikroliter av 100 mikroM renade peptoid i acetonitril: vatten 1:1 (v / v) var blandad med 1 mikroliter av matris (5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic syra i acetonitril: vatten 1:1 v / v och 0,1% TFA) och 1 mikroliter sågs på MALDI plattan. Efter provet lufttorkad var det placeras i Applied Biosystem / MDS SCIEX 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer. Förvärvet och bearbetning av lägena var linjär låg massa. Den beräknade vikten fördes in i den riktade massa för att automatiskt justera för fördröjningstiden. Lasern intensiteten var satt till 3400. De observerade massa, 4981,2, matchar nära den beräknade massan av 4981,74. Den frystorkade renade pulvret löst i DMSO att göra en 2-lösning mM lager, som kan lagras vid 4 ° C. Ark har utarbetats av nämnda protokoll och avbildade med fluorescens optisk mikroskopi och SEM (bild 2 och 3). En mängd olika former med funktionen storlekar på upp till 300 ìm iakttas och notably, raka kanter är framträdande. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" /> Figur 1 sekvensen av block-avgiften peptoid H-[Nae-Npe] 9 -. [IOU-Npe] 9-NH 2. En enda kedja, block laddning, amfifila polypeptoid 36-mer själv monterar i högt beställt, tvådimensionell nanosheets 3. Den beräknade molekylvikt är 4981,74. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" /> Figur 2. Fluorescensmikroskopi bilder av peptoid nanosheets. Ark bildades från en 20 mikroM peptoid lösning i 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Lakanen var avbildade på agaros med 1μM Nilen Röd. Skala barer är 100 ìm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" /> Figur 3. Skanna bilder elektronmikroskopiav peptoid nanosheets. Ark bildades från en 20 mikroM peptoid lösning i 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Skala barer är 5 ìm. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" /> Figur 4 Analytisk omvänd fas HPLC spår av H-[Nae-Npe] 9 -. [IOU-Npe] 9-NH 2. Den råa och renas analytisk HPLC spår (30-80% lutning på 1 ml / min under 30 minuter vid 60 ° C med en C18, 5 ìm, 50 x 2 mm spalt) av den råa och renade block-laddning peptoid H-[ Nae-Npe] 9 - [IOU-Npe] 9-NH 2 visas. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" /> Figur 5 MALDI-TOF-masspektroskopi spår av H-[Nae-Npe] 9 -. [IOU-Npe] 9-NH 2. De observerade massa, 4981,2, är i nära avtal om att den beräknade massan, 4981,74.

<ol>
	<li>King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cleavage+method+which+minimizes+side+reactions+following+Fmoc+solid+phase+peptide+synthesis.">A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis.</a> Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).</li><li>Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaken,+not+stirred:+Collapsing+a+peptoid+monolayer+to+produce+free-floating,+stable+nanosheets.">Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets.</a> J. Am. Chem. Soc. , (2011).</li><li>Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+a+single-chain,+information-rich+polypeptoid+sequence+into+a+highly-ordered+nanosheet.">Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet.</a> Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+multistep+synthesis+of+a+bioactive+peptidomimetic+oligomer+for+the+undergraduate+laboratory.">Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory.</a> J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).</li><li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+peptoids:+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function.">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).</li><li>Zuckermann, R. N., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+as+potential+therapeutics.">Peptoids as potential therapeutics.</a> Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).</li><li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoids+that+mimic+the+structure,+function+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides.">Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> , 105-2794 (2008).</li><li>Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+method+for+detection+of+amyloidogenic+misfolded+proteins.">A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins.</a> Biochem. 50, 4322-4329 (2011).</li><li>Huang, C. -. Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipitoids+-+novel+cationic+lipids+for+cellular+delivery+of+plasmid+DNA+in+vitro.">Lipitoids - novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro.</a> Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).</li><li>Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Br&#228;se, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptoidic+amino-+and+guanidinium-carrier+systems:+Targeted+drug+delivery+into+the+cell+cytosol+or+the+nucleus.">Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li><li>Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+self-assembly+of+a+biomimetic+diblock+copolypeptoid+into+homochiral+super+helices.">Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).</li><li>Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+ultra-thin+two-dimensional+crystals+from+sequence-specific+peptoid+polymers.">Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers.</a> Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+synthesis+of+artificial+proteins:+The+Discovery+of+an+amphiphilic+helical+peptoid+assembly.">Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly.</a> Chemistry &#38; Biology. 9, 647-654 (2002).</li><li>Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combinatorial+approach+to+the+discovery+of+efficient+cationic+peptoid+reagents+for+gene+delivery.">A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).</li><li>Mora, P. u. i. g., Masip, I. s. a. b. e. l., Cort&#233;s, N. u. r. i. a., Marquina, R. e. g. i. n. a., Merino, R. a. m. &. #. 2. 4. 3. ;. n., Merino, J. e. s. &. #. 2. 5. 0. ;. s., Carbonell, T. e. r. e. s. a., Mingarro, I. s. m. a. e. l., Messeguer, A. n. g. e. l., P&#233;rez-Pay&#225;, E. n. r. i. q. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+from+a+positional+scanning+peptoid+library+of+in+vivo+active+compounds+that+neutralize+bacterial+endotoxins.">Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins.</a> J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).</li><li>Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+(N-substituted)glycine+peptoid+Library.">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li><li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library.">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-(substituted)glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+(&amp;alpha;+peptoids)+and+derivatives.">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&amp;alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis.">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li></ol>

Vi har ingenting att lämna ut.

Program och betydelse Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv metod för peptoid syntes och vattenfasen självorganisering av peptoids i nanosheets. De flesta laboratorier lätt kan syntetisera peptoids eftersom billiga material, grundläggande kompetens och enkla tekniker som används 4. Likaså kräver självorganisering av ultra-tunna, högt beställt nanosheets bara upprepade luta en injektionsflaska med en utspädd vattenlösning peptoid lösning 2. Peptoids är lovande material för biomedicinsk och nanovetenskap forskning eftersom de är robusta och syntetiskt flexibla ändå sekvensspecifika och mycket avstämbara 5. Peptoids har visat biologisk aktivitet (Therapeutics 6,7, diagnostik 8, intracellulär leverans 9-10) och vikning i hierarkiska nanostrukturer 3, 11-14. På grund av sin modulära syntes, kombinatoriska peptoid LiBrVädur 15-19 lätt kan syntetiseras och screenas för en bred rad aktiviteter eller egenskaper. I synnerhet nanosheets fungera som en potentiell plattform för tvådimensionell skärm ställningar, mimetika membran, biologiska sensorer, mimetika protein och Komponentframställning. Med praktiskt taget outtömliga olika sekvenser möjligt är rike peptoid forskning expanderar snabbt. Variabler i fast fas submonomer syntes av polypeptoids På grund av möjligheten att välja från en otroligt stor och varierande alfabet monomerer 20 behöver submonomer metoden enstaka ändringar i de fall där öka kopplingen effektiviteten i varje steg kommer att förbättra den totala produkten avkastning. Införande av oskyddade kedjor heterocykliska sida kräver användning av klorättiksyra istället för bromoacetic sura 21. Utökad deplacement och högreamin koncentrationer är vanligen anställda efter ca 20 kopplingar för långa peptoid sekvenser eller mindre nukleofila aminer. Värme reaktionskärlet till 35 ° C, med hjälp av en vattenmantlad reaktionskärl, hjälper till att driva reaktionen. För högt flyktiga aminer som Isopropylaminsalt, måste man vara försiktig för att undvika avdunstning. Aminer i form av en klorid, såsom T-butyl beta-alanin HCl, måste vara fri-baserade innan de introduceras i förskjutning reaktionen. Detta kan uppnås genom att lösa upp eller avbryta amin i DCM (~ 5g amine/25 mL DCM) och neutralisera med en ekvimolära lösning av natriumhydroxid i en separationstratt. DCM lagret samlas in och vattenskiktet tvättas med ytterligare DCM. Den kombinerade DCM lagren torkas över natriumsulfat och filtreras i en pre-vägs rund botten kolv. Avlägsna lösningsmedlet från Rotary avdunstning ge en olja, och notera produktens vikt. During klyvning steget, TFA klyvning cocktail och klyvning tiden är beroende på antal olika skydd används grupper. Riktlinjer för klyvning cocktails liknar traditionella klyftor peptid deprotection 1. Generellt är 10 minuters inkubationer krävs för sekvenser utan att skydda grupper eller sekvenser med få mycket syralabilt skydda grupper (t.ex. BOC trityl). Två timmars inkubationer rekommenderas för sekvenser med svårare skydda grupper (exempelvis t-butyl-ester, MTR, PBF) eller sekvenser med många skydda grupper för att säkerställa full deprotection i varje kedja. Råolja peptoid produkter kommer i allmänhet att lösas upp i acetonitril: vatten 1:1 (v / v), men högre andelar acetonitril är vanligt med sidokedjor med en hög total hydrofobicitet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Dimetylformamid </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99 +% </td></tr><tr><td> N-methylpyrrolidinone </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Bromoacetic Acid </td><td> Acros Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4-Methylpiperidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide </td><td> Chem-Impex </td><td> 001.100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Diklormetan </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS klass </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Trifluorättiksyra </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 233.781 -10G </td><td> För TFA klyvning </td></tr><tr><td> 1,2-dikloretan </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> För siliconization fartyg glas reaktion </td></tr><tr><td> Phenethylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 407.267-100ml </td><td> &gt; 99,5% Hydrophobic sidokedjan amin </td></tr><tr><td> Boc-etylendiamin </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Katjoniska sidokedjan amin </td></tr><tr><td> t-Butyl beta-alanin HCl </td><td> Chem-Impex International </td><td> 04.407 </td><td> Anjoniska sidokedjan amin </td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic syra </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> För MALDI matris </td></tr><tr><td> Nilen Red </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19.123-10mg </td><td> För fluorescens Imaging </td></tr><tr><td> Dichlorodimethylsilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 80.430-500G-F </td><td> För siliconization fartyg glas reaktion </td></tr><tr><td> Disponibel PP porös varukorgås </td><td> Tillämpad Separationer </td><td> 2416 </td><td> 6 ml polypropylen kassett med 20 mm PE-frit </td></tr><tr><td> Disponibel 3-vägs luer-adapter </td><td> Cole Parmer </td><td> 31.200-80 </td><td> Kran för engångsbruk manuell syntes reaktionskärl </td></tr><tr><td> Luer Lock ring </td><td> Cole Parmer </td><td> 45.503-19 </td><td> ¼ &quot;fäste för disponibel manuell syntes reaktionskärl </td></tr><tr><td> Beslag Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45.500-20 </td><td> ¼ &quot;fäste för disponibel manuell syntes reaktionskärl </td></tr><tr><td> Disponibel PP pipetter </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> För TFA överföringar </td></tr><tr><td> Luer Lock spruta av plast </td><td> Nationella vetenskapliga </td><td> S7515-5 </td><td> 6 ml sprutor </td></tr><tr><td> 1 dram glasflaska </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Med fenol gjutna skruvlock med PVC-faced massa liner </td></tr><tr><td> 20 mL scintillation injektionsflaska </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Med bifogade PP-lock och massa folie liner </td></tr><tr><td> Secure-Seal lim spacer </td><td> Invitrogen </td><td> S-24.736 </td><td> För fluorescens avbildning </td></tr><tr><td> Glas diabilder </td><td> Elektronmikroskopi Sciences </td><td> 63.411 </td><td> För fluorescens avbildning </td></tr><tr><td> Täck slip </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> För fluorescens avbildning </td></tr><tr><td> 4 &quot;kiselskiva </td><td> Ted Pella </td><td> 16.007 </td><td> Pre-tärningar i 5x7 mm marker </td></tr><tr><td> 0,45-filter </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> För HPLC. PTFE membran </td></tr><tr><td> Agarosen </td><td> BD </td><td> 212.272 </td><td> För fluorescens avbildning </td></tr><tr><td> SPE Vacuum Manifold </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 57.044 </td><td> Exempel på SPE vakuum grenrör </td></tr><tr><td> Porös glaskärl </td><td> Ace glas </td><td> 6402-12 </td><td> Porositet Cfrit </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Sterilizer </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Exempel på plasma renare för att förbereda kisel chips för SEM </td></tr></tbody></table>

solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets

Peptoids är en ny klass av biomimetiska, icke-naturliga, sekvensspecifika heteropolymers som motstår proteolys, uppvisar stark biologisk aktivitet, och vänd ner högre ordning nanostrukturer. Strukturellt liknande peptider, peptoids är poly N-substituerade Glycines, där sidokedjorna är knutna till kväve snarare än alfa-kolet. Deras enkel syntes och strukturella mångfald kan testa grundläggande konstruktionsprinciper för att driva de novo design och konstruktion av nya biologiskt aktiva och nanostrukturerade material. Här är en enkel manuell peptoid syntes protokoll presenteras som gör syntesen av långa kedjan polypeptoids (upp till 50mers) i utmärkt avkastning. Endast basutrustning, enkla tekniker (t.ex. vätsketransport, filtrering) och kommersiellt tillgängliga reagenser som krävs, vilket gör peptoids ett tillgängligt komplement till många forskare &quot;verktygslådor. Den peptoid ryggraden odlas en monomer i taget motbl.a. submonomer metod som består av två steg monomer Förutom cykel: Acylation och fördrivning. Först bromoacetic Syraaktiverad in situ med N, acylates N&#39;-diisopropylcarbodiimide ett harts-bundna sekundär amin. För det andra nukleofila förskjutning av bromid av en primär amin följer att införa sidokedjan. De två steg cykel upprepas tills önskad kedjan är nådd. Kopplingen effektiviteten i denna två steg cykel överstiger rutinmässigt 98% och möjliggör syntes av peptoids så länge som 50 rester. Mycket avstämbara, exakt och kemiskt olika sekvenser kan uppnås med submonomer metod som hundratals lättillgängliga primära aminer direkt kan införlivas. Peptoids växer fram som en mångsidig biomimetiska material för nanobioscience forskning på grund av deras syntetiska flexibilitet, robusthet, och beställa på atomär nivå. Vikningen av en enda kedja, amfifila, informationtion-rika polypeptoid till ett högt beställt nanosheet har nyligen påvisats. Detta peptoid är en 36-Mer som består av endast tre olika kommersiellt tillgängliga monomererna hydrofoba, katjoniska och anjoniska. Den hydrofoba fenyletyl sidokedjorna är begravda i nanosheet kärnan medan de joniska amin och karboxylgrupper sidokedjor anpassa den hydrofila ansikten. Den peptoid nanosheets fungera som en potentiell plattform för membran mimetika, mimetika protein, Komponentframställning, och sensorer. Metoder för peptoid syntes, plåt bildning och mikroskopi avbildning beskrivs och ger en enkel metod för att möjliggöra framtida konstruktioner peptoid nanosheet.

Watch this Scientific Journal Video about Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets at JoVE.com

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

En enkel och allmänna handboken peptoid syntes metod med basutrustning och kommersiellt tillgängliga reagenser beskrivs, vilket gör peptoids att vara lätt syntetiseras i de flesta laboratorier. Det syntes, rening och karaktärisering av en amfifila peptoid 36mer beskrivs, liksom dess självorganisering i högt beställt nanosheets.

Fast fas Submonomer Syntes av Peptoid polymerer och deras självorganisering till mycket beställt Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape Memory Polymers för Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Riktad Cellular Self-Assembly att tillverka-cellerna Tissue Ringar för Biomekaniska analys och Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontroll av levande celler elektrisk aktivitet av konjugerade polymerer

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

Tillverkning av en Dipol-assisterad Solid Phase Extraction Microchip för spårmetallanalys i vattenprover

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntes av guld nanopartiklar Integrerad fotokänsliga liposomer och mätning av deras mikrobubblor Kavitation på Pulse laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Hög genomströmning identifiering av bakterier Repellent Polymers för medicintekniska produkter

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Fabricera nedbrytbara Thermoresponsive Hydrogels på flera längdskalor via reaktiva extrudering, mikrofluidik, självmontering och Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Syntes av katjoniserad Magnetoferritin för ultrasnabb magnetiseringen av celler

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molekylär igenkänning med Bio-mimetiska Polymers på Single vägg kolnanorör

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Ammonia Synthesis at Low Pressure

Ammoniak syntes vid lågt tryck

Ammonia can be synthesized at low pressure by the use of an ammonia selective absorbent. The process can be driven with wind energy, available locally in ...