Name: in vitro uncoating of hiv-1 cores
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Uncoating of HIV-1 Cores at JoVE.com

HIV-1 uncoating studies in het laboratorium Aiken werden ondersteund door NIH beurzen AI40364, AI50423 en AI076121. Diverse belangrijke stoffen, waaronder reagentia gebruikt in de p24-ELISA, werden verstrekt door de NIH AIDS-onderzoek en Reference Program, Afdeling van aids, NIAID, NIH.

1. De productie van HIV-1 deeltjes Alvorens verder te gaan, moet u toestemming vragen en volg de richtlijnen van de bioveiligheid kantoor van uw instelling om te werken in een bioveiligheid faciliteit goedgekeurd voor infectieuze HIV. U moet ervoor zorgen dat de juiste zorg en veiligheidsmaatregelen worden gevolgd tijdens het werken in de bioveiligheid laboratorium. De productie van HIV-1 deeltjes wordt meestal uitgevoerd door tijdelijke transfectie van 293T-cellen...

<ol>
	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).</li><li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core.">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li><li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li><li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kr&#228;usslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

De hier beschreven methode om HIV-1 kernen te zuiveren om te studeren uncoating in vitro is handig voor het bestuderen van deze fase van de HIV-1 levenscyclus, in het bijzonder als gevolg van onbeschikbaarheid van een gevalideerde methode om HIV-1 uncoating analyseren doelcellen. Hoewel deze methode gebruikt evenwicht ultracentrifugatie te zuiveren kernen, anderen hebben gebruikt direct pilleren na korte lyse met 1% Triton-X-100 12, 13 of pelletering door een sucrose kussen bedekt met 0,1% Triton-X-100 1...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Naam van het reagens </td><td width="197"> Vennootschap </td><td width="114"> Catalogusnummer </td><td width="161"> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% trypsine-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25 tot 053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Samenstelling: 50mm BES [p H 6.95], 280 mM NaCl en 1,5 mM Na 2 HPO 4. Pas de pH op 6,95bij kamertemperatuur. Filter steriliseren en opslaan in porties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Coating antilichaam: Monoklonale antilichamen tegen p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS-onderzoek en referentiereagens Program </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primair antilichaam: HIV-Ig (hyperimmuun menselijke patiënt serum) </td><td> NIH AIDS Research en referentiereagens Program </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Secundair antilichaam: Geit anti-humaan IgG, peroxidase geconjugeerd </td><td> Doorboren </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP-substraat </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 well platen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti en SW32.1 Ti rotors en compatibel ultracentrifuge </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 rotor en tafelblad ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hoge snelheid microfugebuizen tubes </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi Flow dichtheidsgradiënt fractionator </td><td> Labconco Corp </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradient Voormalig </td><td> CBS Scientific Co Inc </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

Het genoom van de retrovirussen is ingekapseld in een capside, omringd door een lipide envelop. Voor lentivirussen, zoals HIV-1, is de conische capside schil bestaat uit CA eiwit ingericht als een rooster van zeshoek. De capside wordt afgesloten door 7 pentamers aan het brede uiteinde en 5 aan het smalle uiteinde van de kegel 1, 2. Ingekapseld in dit capside shell is de virale ribonucleoproteïne complex, en samen vormen ze de kern. Na fusie van de virale membraan met het doel celmembraan, is het HIV-1 vrij in het cytoplasma. De capside demonteert dan het vrijgeven van gratis CA in de oplosbare vorm 3 in een proces aangeduid als uncoating. De intracellulaire locatie en het tijdstip van de HIV-1 uncoating worden slecht begrepen. Enkel aminozuur substituties in Californië, dat de stabiliteit van de capside te veranderen ook afbreuk doen aan het vermogen van HIV-1 tot 4 cellen te infecteren. Dit geeft aan dat de stabiliteit van de capside is essentieel voor HIV-1 infectie. </p&gt; HIV-1 uncoating is moeilijk te bestuderen door een gebrek aan beschikbaarheid van gevoelige en betrouwbare tests voor dit proces. Hier beschrijven we een kwantitatieve methode voor het bestuderen van uncoating in vitro gebruik van kernen geïsoleerd van besmettelijke HIV-1 deeltjes. De aanpak omvat isolement van kernen door sedimentatie van geconcentreerde virionen door een laag van het wasmiddel en in een lineaire sucrose gradiënt, in de kou. Te kwantificeren uncoating, zijn de geïsoleerde kernen geïncubeerd bij 37 ° C voor verschillende getimede intervallen en vervolgens gepelleteerd door ultracentrifugatie. De omvang van uncoating wordt geanalyseerd door het kwantificeren van de fractie van CA in het supernatant. Deze benadering is gebruikt om effecten van virale mutaties te analyseren op HIV-1 capside stabiliteit 4, 5, 6. Het zou ook nuttig zijn voor het bestuderen van de rol van cellulaire factoren die bij HIV-1 uncoating.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Uncoating of HIV-1 Cores at JoVE.com

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is een essentiële stap in de vroege fase van de HIV-1 levenscyclus en wordt gedefinieerd als de demontage van het capside shell en de vrijlating van de virale ribonucleoproteïne complex (vRNP). Hier tonen we technieken voor het isoleren van intacte kernen van HIV-1 virionen en voor de kwantificering van hun uncoating<em&gt; In vitro</em&gt;.

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...