Name: in vitro uncoating of hiv-1 cores
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00
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HIV-1 uncoating Studien in den Aiken Labor wurden von NIH gewährt AI40364, AI50423 und AI076121 unterstützt. Mehrere wichtige Materialien, einschließlich Reagenzien in der p24 ELISA verwendet wurden, wurden durch die NIH AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH zur Verfügung gestellt.

1. Produktion von HIV-1 Partikel Bevor Sie fortfahren, müssen Sie eine Genehmigung erhalten und befolgen Sie die Anweisungen aus dem Biosafety Büro Ihrer Institution in einem Biosafety-Anlage für infektiöse HIV genehmigten Arbeitsprogramms. Sie müssen sicherstellen, dass die richtige Pflege und Sicherheitshinweise sind während der Arbeitszeit in der Biosicherheit Labor. Produktion von HIV-1 Partikel ist in der Regel durch transiente Transfektion von 293T-Zell...

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	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. 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N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li><li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kr&#228;usslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

Die hier beschriebene Methode zur HIV-1-Kerne zu reinigen, um studieren uncoating in vitro ist für das Studium dieser Phase der HIV-1 Lebenszyklus, vor allem aufgrund der Nichtverfügbarkeit eine validierte Methode zur HIV-1 uncoating in Zielzellen zu analysieren nützlich. Obwohl diese Methode verwendet Gleichgewicht Ultrazentrifugation zu Kernen zu reinigen, andere haben direkte Pelletierung nach kurzer Lyse verwendet mit 1% Triton-X-100 12, 13 oder Pelletierung durch eine Saccharose-Kissen mit 0,1% Triton...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Name des Reagenzes </td><td width="197"> Firma </td><td width="114"> Katalog-Nummer </td><td width="161"> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> CellGro </td><td> 21 bis 031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Zusammensetzung: 50 mM BES [p H 6.95], 280 mM NaCl und 1,5 mM Na 2 HPO 4. Der pH-Wert auf 6,95bei Raumtemperatur. Filter sterilisieren und lagern in Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Coating-Antikörper: Monoklonale Antikörper gegen p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Programm </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primärer Antikörper: HIV-Ig (hyperimmune menschlichen Patienten Serum) </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Programm </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Sekundäre Antikörper: Anti-Human-IgG, Peroxidase-konjugierten </td><td> Durchstechen </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP-Substrat </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96-Well-Platten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti und SW32.1 Ti Rotoren und kompatibel Ultrazentrifuge </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 Rotor-und Tabletop-Ultrazentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> High speed Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi Flow-Dichtegradienten Fraktionator </td><td> Labconco Corp </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradient Ehemalige </td><td> CBS Scientific Co. Inc. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

Das Genom der Retroviren ist verpackt in einem Kapsid von einer Lipid-Hülle umgeben. Für Lentiviren wie HIV-1, ist die konische Kapsid Schale CA-Protein als ein Gitter aus Sechseck angeordnet sind. Das Kapsid ist um 7 Pentamere auf das breite Ende und 5 am schmalen Ende des Konus 1, 2 geschlossen. Eingeschlossen in diese Kapsid-Shell ist die virale Ribonukleoproteinkomplex, und zusammen umfassen sie den Kern. Nach der Fusion der Virushülle mit der Zellmembran Ziel ist die HIV-1 in das Zytoplasma freigesetzt. Das Capsid dann zerlegt veröffentlicht kostenlose CA in die lösliche Form 3 in einem Prozess genannt uncoating. Die intrazelluläre Ort und Zeitpunkt des HIV-1 uncoating sind weitgehend unverstanden. Einzel-Aminosäure-Substitutionen in CA, dass die Stabilität des Kapsid verändern ebenfalls beeinträchtigen die Fähigkeit des HIV-1 auf Zellen 4 zu infizieren. Dies deutet darauf hin, dass die Stabilität des Kapsid von entscheidender Bedeutung für HIV-1 Infektion ist. </p&gt; HIV-1 uncoating wurde schwer Studie aufgrund mangelnder Verfügbarkeit von sensitiven und zuverlässigen Tests für diesen Prozess. Hier beschreiben wir eine quantitative Methode zur Untersuchung uncoating in vitro mit Kernen von infektiösen HIV-1 Partikel isoliert. Der Ansatz beinhaltet Isolierung der Kerne durch Sedimentation von konzentrierten Virionen durch eine Schicht von Wasch-und in eine lineare Saccharose-Gradienten, in der Kälte. Zur Quantifizierung uncoating werden die isolierten Kerne bei 37 ° C für verschiedene Zeitintervalle und anschließend pelletiert durch Ultrazentrifugation. Das Ausmaß der uncoating wird durch die Quantifizierung der Anteil der CA in den Überstand analysiert. Dieser Ansatz wurde eingesetzt, um Effekte von viralen Mutationen auf HIV-1 Capsid Stabilität 4, 5, 6 zu analysieren. Es sollte auch für die Untersuchung der Rolle zellulärer Faktoren in HIV-1 uncoating.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer uncoating<em&gt; In-vitro-</em&gt;.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...