Name: in vitro uncoating of hiv-1 cores
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00
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VIH-1 uncoating estudios en el laboratorio Aiken fueron apoyados por las subvenciones del NIH AI40364, AI50423 y AI076121. Varios materiales clave, como los reactivos utilizados en el p24 ELISA, fueron proporcionados por la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de referencia de la División de SIDA, NIAID, NIH.

1. La producción de partículas de VIH-1 Antes de continuar, usted debe obtener el permiso y seguir las directrices de la oficina de Bioseguridad de la institución para trabajar en un centro de bioseguridad aprobada por el VIH infeccioso. Usted debe asegurarse de que el cuidado y las precauciones de seguridad son seguidos durante el trabajo en el laboratorio de bioseguridad. La producción de partículas de VIH-1 se realiza típicamente mediante transfección tra...

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	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. 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N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

El método descrito aquí para purificar el VIH-1 para estudiar los núcleos uncoating in vitro es útil para el estudio de esta fase del ciclo de vida del VIH-1, sobre todo debido a la falta de un método validado para analizar el VIH-1 uncoating en las células diana. Aunque este método utiliza el equilibrio ultracentrifugación para purificar los núcleos, otros han utilizado granulación directa después de la lisis breve con un 1% Triton X-100-12, 13 o granulación a través de un colchón de sacarosa r...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Nombre del reactivo </td><td width="197"> Empresa </td><td width="114"> Número de catálogo </td><td width="161"> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 a 031 CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25 a 053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Composición: 50 mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl y 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajustar el pH a 6,95a temperatura ambiente. Filtro de esterilizar y almacenar en alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Anticuerpo de recubrimiento: Anticuerpo monoclonal para p24 (183-H12-5C) </td><td> SIDA de los NIH Programa de Investigación y Referencia Reactivo </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primaria de anticuerpos de VIH-Ig (suero hiperinmune paciente humano) </td><td> NIH Investigación sobre el SIDA Programa de referencia y los reactivos </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo secundario: De cabra anti-IgG humana, conjugado con peroxidasa </td><td> Atravesar </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP sustrato </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB placas de 96 pocillos </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti SW32.1 y rotores de Ti y ultracentrífuga compatible </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 de rotor y ultracentrífuga de mesa </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alta velocidad de los tubos de microcentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi densidad de flujo gradiente fraccionador </td><td> Labconco Corp. </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradiente de ex </td><td> CBS Scientific Co. Inc. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

El genoma de los retrovirus está encerrado en una cápside rodeado por una envoltura lipídica. Para los lentivirus como el VIH-1, la cónica cápside está compuesta de proteína CA organizó como una red de hexágono. La cápside está cerrado por siete pentámeros en la punta gruesa y 5 en el extremo estrecho del cono 1, 2. Encerrado en esta cápside se encuentra el complejo ribonucleoproteína viral, y juntos constituyen el núcleo. Después de la fusión de la membrana viral con la membrana celular de destino, el VIH-1 es liberado en el citoplasma. La cápside se desmonta la liberación libre de CA en forma soluble 3 en un proceso conocido como uncoating. La localización intracelular y el momento del VIH-1 uncoating son poco conocidos. Solo sustituciones de aminoácidos en la CA que alteran la estabilidad de la cápside también afectar la capacidad del VIH-1 para infectar las células 4. Esto indica que la estabilidad de la cápside es fundamental para la infección VIH-1. </p&gt; VIH-1 uncoating ha sido difícil de estudiar debido a la falta de disponibilidad de ensayos sensibles y fiables para este proceso. Aquí se describe un método cuantitativo para el estudio de uncoating in vitro utilizando núcleos aislados de infecciosas del VIH-1 partículas. El enfoque incluye el aislamiento de los núcleos por la sedimentación de los viriones concentrada a través de una capa de detergente y en un gradiente lineal de sacarosa, en el frío. Para cuantificar uncoating, los núcleos aislados se incuban a 37 ° C durante varios intervalos de tiempo y, posteriormente, se sedimentaron por ultracentrifugación. El grado de uncoating se analiza mediante la cuantificación de la fracción de CA en el sobrenadante. Este enfoque ha sido empleado para analizar los efectos de las mutaciones virales de VIH-1 en la estabilidad de la cápside 4, 5, 6. También puede ser útil para estudiar el papel de los factores celulares del VIH-1 uncoating.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating es un paso esencial en la fase temprana del ciclo de vida del VIH-1 y se define como el desmontaje de la cápside y la liberación de los complejos de ribonucleoproteína viral (vRNP). En este sentido, demostrar las técnicas para el aislamiento de los núcleos intactos del VIH-1 viriones y cuantificar sus uncoating<em&gt; In vitro</em&gt;.

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...