Name: a simple method for imaging arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium
Uploaded: 2012-01-16T13:00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות פרופ &#39;ניקולס סמירנוף מאוניברסיטת אקסטר את עצתו של אוניברסיטת אקסטר מתקן bioimaging. המימון ניתן על ידי בריטניה ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (מענק התייחסות BB/E002682/1).

פרוטוקול כדלקמן מתאר שיטה פשוטה לשימוש PFD כמדיום הרכבה infiltrative בעלים thaliana ארבידופסיס, אך אנו צופים כי בשיטה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים בהם הדמיה אוויר עשיר ברקמות הוא הרצוי. 1. עלה דגימות הרכבה ב PFD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שקופית מיקרוסקופ עם אטם גז חדיר של polydimethylsiloxane (PDMS, ג&#39;ל קרוליינה תצפית). PDMS הוא פולימר viscoelastic והוא יכול להיות מעוצב על מנת לספק קאמרית המותאמים לדרישות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן PFD עם האוויר. זו יכולה להיות מושגת על ידי מבעבע עם אוויר או על ידי רעד נפח קטן של PFD בבקבוק אוויר מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PFD למזוג לתוך צלחת פטרי פתוחה לצוף שתיל כולו או עלה נכרת על PFD במשך 5 דקות. הרקמה צריך להיות שקוף, המזכירים רקמות מזוגגת (איור 2 (א)). עלים עשוי להופיע כהה או בהיר יותר מאשר לפני החשיפה PFD, depenדינג על תנאי תאורה לגיל רקמות בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את תא PDMS עם PFD אוויר equilibrated ובזהירות להעביר את דגימות רקמה מן צלחת פטרי הדגירה לחדר PDMS. חותם את השקופית עם coverslip ותמונה על פי דרישות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: PFD גם מתפקדת היטב בתא פתוח בנוי על coverslip או בתא זלוף והוא תואם עם גריז סיליקון. PFD אינו תואם טפלון רכיבים כמו מתמוסס להם. </li></ol> 2. נציג תוצאות: בדיקה מיקרוסקופית של PFD-מודגרות דגימות עלים מראה כי הרוב המכריע של airspaces מוצפים. איור 2 (ב) מראה airspaces מוצף GFP רקומביננטי תלויה PFD. ניכר כי עלה מוצף על הדגירה עם PFD, אך פה ושם כיסי אוויר עשויים להישאר. מים לא להציף את עלה בתנאים אלה. LSCM של דגימות מודגרות ועלה ב<html> ir, מים או מראה כי PFD PFD נותן יתרון על פני מים ואוויר לעומק של הדמיה אפשרי (איור 3). הדוגמה שניתנה איור 3 מראה, אוויר ומים PFD ארבידופסיס רכוב עלי להביע את ונוס מקומי cytosolically, סוג של YFP 11 כי הוא הביע constitutively תחת האמרגן 35S. אנו יכולים לראות גידול של פי 2 בקירוב לעומק של הדמיה כאשר משווים PFD ומים. יצוין, עם זאת, כי השיפור מדויק לראות בעת שימוש PFD משתנה עם צמצם המספרי של העדשה ואת סוג של רקמה בשימוש. ראינו נהירה cytoplasmic ושיער התארכות שורש שתילים שטופלו PFD, שכל אחד מהם מעיד על צמחים בריאים. בנוסף הראינו כי 2 Fv / Fm, מידה מסוימת של תפקוד הפוטוסינתזה של צמחים 12 נשאר בגבולות נסבלים על לוחות הזמנים בשימוש בתחום ההדמיה. 3394fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. עלה הצמח המורכבות ואת ההשלכות אופטי ייצוג Diagrammatical מראה את תכונות אנטומיות של א &#39; thaliana עלה ביחס אופטי הגדרת. קיצורים בהם נעשה שימוש הם obj. = המטרה העדשה, IMM. = נוזל טבילה, Cov. = Coverslip, mnt. = Mountant, לחתוך. = לציפורן, המודעה. EP. = האפידרמיס adaxial, st. = נקבובית הפיוניות, SP. = Mesophyll ספוגי, כפי = חלל האוויר, חבר. = Mesophyll משוכה, vb = חבילה של כלי הדם, המודעה. EP. = Adaxial האפידרמיס. קירות התא מסומנים על ידי קווים שחורים. <img alt="באיור 2." src="/files/ftp_upload/3394/3394fig2.jpg" /> באיור 2. PFD חודר בקלות עלים ארבידופסיס (א) עלים מודגרות באוויר, במים או PFD במשך 5 דקות, צילמו במצלמה דיגיטלית DCF3000FX לייקה עם מיקרוסקופ הלייקה MZ16F (Leica Microsystems (בריטניה) בע&quot;מ, מילטון קיינס, אנגליה). הלוגו יופיטר היה מודפס על הסרט אצטט והאירו הלוך ושובמ &#39;מתחת עם תיבת אור. זמן חשיפה היה 89 ms וכל התמונות נאספו ועובדו זהה. ברים סולם מייצגים 2 מ&quot;מ. (ב) PFD נושאת מטוהרים רקומביננטי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) התוחם airspaces in vivo. ה-GFP הוא בצבע ירוק שווא, אדום משמש להראות כלורופיל אוטומטי הקרינה, אשר התוחם את התאים mesophyll. (איור 2 (ב) רשות לשכפל עם פרטים טכניים מלאים זמינים Littlejohn et al. 2010 2). ברים סולם מייצגים 25 מ &#39; <img alt="באיור 3." src="/files/ftp_upload/3394/3394fig3.jpg" /> באיור 3. PFD משפר הדמיה confocal בעלים תמונות LSCM מראה מקומי cytoplasmically ונוס פלואורסצנטי (ירוק) ו autofluorescence כלורופיל (אדום) ב thaliana א עלים שלמים צילמו באוויר, במים או PFD. גל עירור היה 514 ננומטר פליטת הקרינה נרשמה ננומטר 518 604 ננומטר עבור ונוס ב 657 ננומטר679 ננומטר עבור כלורופלסטים. פאנל כל קטע confocal יחיד שנלקח מחסנית-Z של 11 תמונות confocal רכשה ב 5 מרווחי מיקרומטר. אלה היו מופק ערימה-Z מלא של 59 תמונות שנרכשו ב 1 במרווחים מיקרומטר, אשר שימשו להפקת סרטים משלים. מדידות עומק מקבלים יחסית אל פני השטח אפידרמיס. תמונות הנציג, אשר עובדו זהה, מוצגים. פרטים ניסויית כגון הגדרות מיקרוסקופ זהים לאלה שנמצאו Littlejohn et al. 2010 2. Scalebars מייצגים 20 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Inoue, S., Pawley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foundations+of+Confocal+Scanned+Imaging+in+Light+Microscopy.">Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. , 1-16 (2006).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. m. i. r. n. o. f. f., N, ., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+substantially+improves+confocal+depth+resolution+in+air-filled+tissues.">Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues.</a> New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Sargent, J. W., Seffl, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+perfluorinated+liquids.+Fed.">Properties of perfluorinated liquids. Fed.</a> Fed. Proc. 29, 1699-1703 (1970).</li><li>Sch&#246;nherr, J., Bukovac, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+stomata+by+liquids.">Penetration of stomata by liquids.</a> Plant Physiol. 49, 813-819 (1972).</li><li>Davies, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+ventilation.">Liquid ventilation.</a> Paediatr. Child. Health. 35, 434-437 (1999).</li><li>Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+ventilation+in+premature+lambs:+uptake,+biodistribution+and+elimination+of+perfluorodecalin+liquid.">Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).</li><li>Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+perfluorocarbon+liquids+in+vitreoretinal+surgery.">The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery.</a> Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).</li><li>Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+blood:+synthetic+substitutes+from+fluorinated+compounds.">Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds.</a> Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).</li><li>Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+responses+of+plant+protoplasts+to+culture+with+oxygenated+perfluorocarbon.">Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorocarbons+to+study+freezing+in+plant+tissues.">Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

זוהי טכניקה פשוטה וקלה לשימוש כדי לשפר את מיקרוסקופית של אוויר מלא או אופטית רקמות מורכבות. הראינו כי הטכניקה יש כמה יתרונות חזקים ואנו מקווים כי הוא ישמש להבהיר שאלות ביולוגיות הנוגעות אוויר עשיר רקמות. לדוגמה זה יהיה בחירה טבעית עבור מחקרים של ההתקפה הפתוגן ב mesophyll צמח או הריאות. אנו גם מודעים למגבלות של הטכניקה. אנחנו עובדים על התאמה טובה יותר מקדם השבירה, לשימוש עם מצבים אחרים של מיקרוסקופיה, ומילוי perfluorocarbon mountant במהלך הניסויים זמנים ארוכים. אנו גם מכירים, עם זאת, כי אחד היתרונות העיקריים של PFCs, כלומר להיות אינרטי מבחינה ביולוגית יש flipside. PFCs אינם מתמוססים בקלות מולקולות ביולוגיות אשר גם מרמז כי הם אינם יכולים לשמש בקלות לספק תרכובות של עניין, כגון הורמונים, תרופות מולקולות קטנות או יונים אחרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> F2 כימיקלים </td><td> N / A </td><td> טלפון להזמנה. </td></tr><tr><td> קרוליינה תצפית ג&#39;ל </td><td> ביולוגית להבים </td><td> 13-2700 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for imaging arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium

הבעיה של רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה עמוק לתוך דגימות ביולוגיות היא להכרה נרחבת 1. ברקמת אוויר מלא כגון mesophyll הספוגי של עלי הצמח או הריאות חוליות קשיים נוספים נובעים מעברים מרובים מקדם השבירה בין מרכיבים תאיים, בין התאים airspaces ובין הרקמה הביולוגית ואת שאר מערכת אופטית. יתר על כן, חוסר התאמה מקדם השבירה להוביל הנחתה של עירור ופליטה fluorophore האות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנו מתארים כאן את היישום של perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), כאמצעי הדמיה אופטית infiltrative אשר משפר לייזר מיקרוסקופיית confocal (LSCM) הדמיה מדגם בעומק, מבלי להזדקק מגביר פגיעה בשלטון לייזר ויש לו השפעה פיזיולוגית מינימלית 2. אנו מתארים את הפרוטוקול לשימוש PFD עם רקמת עלה ארבידופסיס thaliana, אשר מורכב אופטית כתוצאה שלהמבנה (איור 1). PFD יש מספר תכונות שהופכות אותו מתאים לשימוש הזה 3. מקדם השבירה של PFD (1.313) דומה לזו של מים (1.333), והוא קרוב יותר לזה של cytosol (כ 1.4) מאשר אוויר (1.000). בנוסף, PFD זמינה, ללא ניאון אינו רעיל. מתח הפנים הנמוך של PFD (19 dynes -1 ס&quot;מ), נמוכה מזו של מים (72 dynes -1 ס&quot;מ) וגם מתחת לגבול (25-30 ס&quot;מ Dyne -1) עבור חדירה הפיוניות 4, המאפשר לה להציף mesophyll airspaces ספוגי ללא יישום של ואקום פוטנציאל הרסני או פעילי שטח. לבסוף ו מכריע, PFD בעל קיבולת גדולה המסת CO 2 ו-O 2, אשר מאפשר חילופי גזים להישמר ברקמה מוצף, ובכך ממזערת את ההשפעה הפיזיולוגית על המדגם. מאפיינים אלה היו בשימוש ביישומים שונים הכוללים נשימה נוזלי חלקי הריאות inflation 5,6, 7 ניתוחים, דם מלאכותי 8, חמצון של צמיחה מדיה 9, ומחקרים של היווצרות קרח קריסטל בצמחים 10. כיום, מקובל לעלות רקמות במים או חיץ מימית הדמיה confocal לחיות. אנו רואים כי השימוש PFD כמדיום הרכבה מהווה שיפור על הנוהג הקיים ומאפשרת הכנת פשוט לחיות דגימות עלים שלמים הדמיה.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium at JoVE.com

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק הדמיה<em&gt; ארבידופסיס thaliana</em&gt; עלה רקמה עם השפעה פיזיולוגית מינימלית.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור<em&gt; בטוטו</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt; פיתוח

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt; כדוגמה

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...