Name: a simple method for imaging arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium
Uploaded: 2012-01-16T13:00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Николая Смирнова из Университета Эксетера за совет и Университет фонда Bioimaging Эксетер. Финансирование было предоставлено Великобритании биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (грант ссылкой BB/E002682/1).

Протокол ниже описан простой способ использования ПФО как инфильтративный монтажа среды в Arabidopsis thaliana листьев, но мы ожидаем, что этот метод может быть использован в различных приложениях, где изображения воздух богатых тканей желательно. 1. Монтажный лист образцов в ПФО <ol><li> Подготовка предметное стекло с газопроницаемых прокладка полидиметилсилоксана (PDMS, Каролина Наблюдение гель). PDMS является вязкоупругих полимеров и можно формовать, чтобы обеспечить камере с учетом экспериментальных требованиям. </li><li> Равновесие ПФО с воздухом. Это может быть достигнуто путем пропускания с воздухом или при встряхивании небольшом объеме ПФО в заполненных воздухом бутылку. </li><li> Декантировать ПФО в открытую чашку Петри и плавать весь рассады или вырезают лист на ОФП в течение 5 минут. Ткань должна стать прозрачным, напоминает керамической ткани (рис. 2 (а)). Листья могут быть темнее или светлее, чем до воздействия ПФО, зависимостьдинь от условий освещения и возраст ткани используются. </li><li> Заполнить камеру PDMS с воздухом уравновешенную ПФО и тщательно передачи образцов тканей блюдо инкубации Петри в камеру PDMS. Печать слайда с покровным и изображения в соответствии с экспериментальным требованиям. </li><li> Примечание: ПФО также хорошо работает в открытой камерой построенной на покровное или в перфузии камеру и совместим с силиконовой смазки. ПФО не совместим с компонентами тефлон, как она растворяет их. </li></ol> 2. Представитель Результаты: Микроскопический осмотр ПФО инкубировали образцы листьев показывает, что большая часть воздушного пространства затоплены. Рисунок 2 (В) показывает, воздушного пространства залиты рекомбинантного GFP приостановлено в ПФО. Очевидно, что лист затопленных при инкубации с ПФО, но это случайные карманы воздуха может остаться. Вода не наводнение листьев в этих условиях. LSCM образцов инкубировали и монтируется в<html> л, вода или ПФО показывает, что ПФО дает преимущество по сравнению с водой и воздухом в глубине изображения возможно (рис. 3). Пример, приведенный на рисунке 3 показано, воздуха, воды и ПФО установлены Arabidopsis листьев выражения cytosolically локализованных Венера, вариант YFP 11, что выражается конститутивно под 35S промотора. Мы видим примерный 2-кратное увеличение глубины изображения при сравнении ПФО и воды. Следует отметить, однако, что точное улучшение видели при использовании ПФО меняется с числовой апертурой объектива и тип ткани используется. Мы видели, цитоплазматические потокового и удлинение корень волоса в ПФО лечение саженцы, каждый указывает на здоровые растения. Кроме того, мы показали, что 2 Fv / Fm, мерой фотосинтеза функционирования растений 12 остается в допустимых пределах в течение сроков, используемый в области обработки изображений. 3394fig1.jpg &quot;/&gt; Рисунок 1. Завод сложности листа и оптического последствия Схематично представление показывает анатомические особенности А. thaliana листа по отношению к оптической установки. Сокращения, используемые в объект. = Объектива, IMM. = Иммерсионной жидкости, СОУ. = Покровное, шоссе. = Mountant, вырезать. = Кутикулы, объявления. эп. = Адаксиальной эпидермиса, ул. = Устьичного пор, зр. = Губчатого мезофилла, а = воздушного пространства, приятель. = Частокол мезофилла, VB = сосудистого пучка, объявления. эп. = Адаксиальной эпидермиса. Клеточные стенки, обозначены черными линиями. <img alt="Рисунок 2." src="/files/ftp_upload/3394/3394fig2.jpg" /> Рисунок 2. ПФО легко проникает Arabidopsis листьев () Листья инкубировали в воздухе, воде или ПФО в течение 5 минут и отображаемого использованием Leica DCF3000FX цифровую камеру с микроскопом Leica MZ16F (Leica Microsystems (Великобритания) Ltd, Милтон Кейнс, Великобритания). Юпитер логотип был напечатан на ацетатной пленки и освещенные сюдам ниже с световой короб. Экспозиция составила 89 мс, а все изображения были собраны и обработаны одинаково. Шкала бары представляют 2 мм. (Б) ПФО проведении очищенный рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок (GFP) ограничивает воздушного пространства в естественных условиях. GFP является ложным окрашены в зеленый и красный используется, чтобы показать хлорофилла авто-флуоресценции, которая разграничивает клеток мезофилла. (Рис. 2 (б) воспроизводится с разрешения и полное технические детали доступны в Littlejohn и соавт. 2010 2). Шкала бары представляют 25 м. <img alt="Рисунок 3." src="/files/ftp_upload/3394/3394fig3.jpg" /> Рисунок 3. ПФО улучшает конфокальной микроскопии в листьях LSCM изображения, показывающие цитоплазматически локализованных Венеры флуоресценции (зеленый) и хлорофилла аутофлюоресценция (красный) в интактных thaliana А. листьев отображается в воздух, воду или ПФО. Длина волны возбуждения была 514 нм и флуоресценции излучение было зафиксировано в 518 нм 604 нм для Венеры и при 657 нм679 нм для хлоропластов. Каждая панель представляет собой один конфокальный разделе взяты из Ъ-стек 11 конфокальных изображений, полученных при 5 мкм интервалами. Они были извлечены из полного Z-стек из 59 изображений, полученных на 1 мкм интервалов, которые были использованы для подготовки дополнительных фильмов. Глубина измерений приведены по отношению к эпидермальным поверхности. Представитель изображений, которые обрабатываются одинаково, показаны. Экспериментальные данные, такие как микроскоп настройки аналогичны тем, которые содержатся в Littlejohn и соавт., 2010 2. Scalebars представляют 20 мкм.

<ol>
	<li>Inoue, S., Pawley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foundations+of+Confocal+Scanned+Imaging+in+Light+Microscopy.">Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. , 1-16 (2006).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. m. i. r. n. o. f. f., N, ., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+substantially+improves+confocal+depth+resolution+in+air-filled+tissues.">Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues.</a> New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Sargent, J. W., Seffl, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+perfluorinated+liquids.+Fed.">Properties of perfluorinated liquids. Fed.</a> Fed. Proc. 29, 1699-1703 (1970).</li><li>Sch&#246;nherr, J., Bukovac, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+stomata+by+liquids.">Penetration of stomata by liquids.</a> Plant Physiol. 49, 813-819 (1972).</li><li>Davies, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+ventilation.">Liquid ventilation.</a> Paediatr. Child. Health. 35, 434-437 (1999).</li><li>Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+ventilation+in+premature+lambs:+uptake,+biodistribution+and+elimination+of+perfluorodecalin+liquid.">Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).</li><li>Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+perfluorocarbon+liquids+in+vitreoretinal+surgery.">The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery.</a> Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).</li><li>Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+blood:+synthetic+substitutes+from+fluorinated+compounds.">Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds.</a> Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).</li><li>Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+responses+of+plant+protoplasts+to+culture+with+oxygenated+perfluorocarbon.">Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorocarbons+to+study+freezing+in+plant+tissues.">Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Это простой и легкий в использовании техники для улучшения микроскопии заполненных воздухом или оптически комплекс тканей. Мы показали, что метод имеет ряд существенных преимуществ, и мы надеемся, что он будет использоваться, чтобы выяснить биологические вопросы, связанные с воздушным богатых тканей. Например, было бы естественным выбором для исследования патогенных атаке в растительных мезофилла или в легких. Мы также осознаем ограниченность техники. Мы работаем над лучшей преломления соответствующий индекс, используйте с другими видами микроскопии и перфторуглеродов mountant пополнения в течение длительных сроков экспериментов. Мы также признаем, однако, что одним из основных преимуществ ПФУ, то есть быть биологически инертным есть обратная сторона. ПФУ не растворяются биологических молекул, которая также подразумевает, что они не могут быть легко использованы для доставки соединений, представляющих интерес, таких как гормоны, наркотики, и других малых молекул или ионов.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Химические вещества F2 </td><td> N / A </td><td> Телефон на заказ. </td></tr><tr><td> Каролина Наблюдение гель </td><td> Лезвия Биологическая </td><td> 13-2700 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for imaging arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium

Проблема получения изображений с высоким разрешением вглубь биологических образцов широко признается 1. В заполненных воздухом ткани, такие как губчатые мезофилла листьев растений или позвоночных легкие дополнительные трудности возникают из нескольких переходов в преломления между клеточными компонентами, между клетками и воздушного пространства, а также между биологической ткани и остальной частью оптической системы. Более того, показатель несоответствия индекса приводит к затуханию флуорофора возбуждения и эмиссии сигнала в флуоресцентной микроскопии. Мы описываем здесь применение перфторуглеродов, perfluorodecalin (ПФО), как инфильтративный среду визуализации который оптически улучшает лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) образец изображения на глубине, не прибегая к повреждающим увеличения мощности лазера и оказывает минимальное физиологическое воздействие 2. Мы опишем протокол для использования в ПФО с Arabidopsis thaliana ткани листа, который является оптически сложным, как в результате егоструктуры (рис. 1). ПФО имеет ряд атрибутов, которые делают его подходящим для этих целей 3. Преломления ПФО (1,313), сопоставима с показателями воды (1,333) и ближе к цитозоле (около 1,4), чем воздух (1.000). Кроме того, ПФО легко доступна, не флуоресцентные и не токсичен. Низкое поверхностное натяжение ПФО (19 дин см -1) ниже, чем у воды (72 дин см -1), а также ниже предела (25 - 30 дин см -1) для проникновения устьичного 4, что позволяет ей наводнения губчатого мезофилла воздушного пространства без применения потенциально разрушительные вакууме или поверхностно-активных веществ. Наконец, и самое главное, ПФО имеет большой потенциал для растворения СО 2 и О 2, которая позволяет газообмен будет поддерживаться в затопленном ткани, таким образом минимизируя влияние на физиологические образца. Эти свойства были использованы в различных приложениях, которые включают частичное жидкости дыхания и легких инфляцииТион 5,6, хирургия 7, искусственной крови 8, оксигенации питательной среды 9, и исследования кристаллов льда образование в растениях 10. В настоящее время он является общим для монтирования ткани в воду или водный буфер для живых конфокальной микроскопии. Мы считаем, что использовать ПФО в качестве монтажной среда представляет собой улучшение по существующей практике и позволяет простым подготовки живых образцов цельной лист для работы с изображениями.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium at JoVE.com

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Мы описываем использование perfluorodecalin как инфильтративный монтажа среды. Это простой способ улучшения глубину изображения в<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ткани листа с минимальным физиологическим воздействием.

Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Пиросеквенирования: Простой метод для точного генотипирования

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Экс-ово Куриного эмбриона культуры систему, пригодную для обработки изображений и микрохирургии Приложения

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Сотовые конкретного анализа<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Настройка простого Light Лист микроскоп для<em&gt; В Тото</em&gt; Визуализация<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Разработка

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Инфильтрации центрифугирования Техника для извлечения апопластической Жидкость из листьев растений, используя<em&gt; Phaseolus обыкновенная</em&gt; Как пример

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Дискриминация и характеристика гетеросекулярных групп населения с использованием методов количественной визуализации

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Стандартный метод стерилизации высок объём Arabidopsis семян

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Imaging FITC-декстран репортером для регулируемых экзоцитоз

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...