Name: intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas
Uploaded: 2011-11-06T14:00:00
Duration: 9 min 46 s
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Vorremmo ringraziare il dottor Joshua B. Rubin per il generoso dono dei plasmidi per il sistema di lentivirus e Mahil Rao per il suggerimento utile per la preparazione della GL261-luc cellule. Ringraziamo gli studenti Sostenere Tumore Brain Research (SSBTR), The Barrow Neurological Fondazione e la Fondazione Wallace per il loro generoso sostegno. Esperimenti su animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso dell&#39;Ospedale San Giuseppe e Medical Center.

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	<li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li><li>Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. i. m., Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ketogenic+diet+reverses+gene+expression+patterns+and+redudes+reactive+oxygen+species+levels+when+used+as+an+adjuvant+therapy+for+glioma.">The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma.</a> Nutr Metab. 7, (2010).</li><li>Caliper Life Sciences, Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems. , (2010).</li><li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+are+essential+for+priming+but+inefficient+for+boosting+antitumour+immune+response+in+an+orthotopic+murine+glioma+model.">Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model.</a> Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).</li></ol>

Accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Caliper Life Sciences.

L&#39;inoculo delle cellule è infuso ad una profondità di 2,6 mm dalla superficie del cervello dopo la creazione di una tasca 0,4 mm. Per garantire il corretto posizionamento e la profondità dell&#39;ago una radiografia può essere assunto con un C-Arm o simili a raggi X dispositivo di intensificazione dell&#39;immagine, ma questo è opzionale. Le complicanze della chirurgia possono insorgere se l&#39;animale non è adeguatamente sedato, a quel punto l&#39;animale può muoversi durante l&#39;infusione delle cellule. Questo può causare perdite di miscela di cellule o sanguinamento da pista ago. Perdita di cellule causa la crescita ectopica di cellule tumorali. E &#39;anche importante non forare il ventricolo, che può essere fatto se l&#39;è fatta burrhole mediale a mm 2,3 descritte nel protocollo 4. Il corretto posizionamento della diffusione ago e cellulari è stato testato infondendo un mouse con 2 colorante blu di metilene microlitri e sezionare il tessuto cerebrale per verificare la posizione del colorante infuso. In questo protocollo abbiamo utilizzato lo spettro IVIS imaging in vivo del sistema e tha Living software Image (v 4.0) progettato per essere utilizzato con questo strumento. (Caliper Life Sciences). Qualsiasi paragonabile sistema di imaging in vivo e gli strumenti di analisi delle immagini può essere usata per ottenere risultati simili. Questi sistemi offrono alcuni vantaggi rispetto ai tradizionali risonanza magnetica (MRI) per seguire la crescita di un tumore sperimentale intracranica. Il più evidente è il costo relativo dei 2 strumenti - Macchine per animali RM sono molto più costosi e di solito richiedono i servizi di un tecnico specializzato risonanza magnetica. Imaging in vivo, come ciò che è stato qui descritto può essere effettuata dall&#39;utente finale. I dati bioluminescenza è quantitativa, mentre la quantificazione dei dati MRI è in termini di tempo e un po &#39;inesatto. Inoltre, le immagini MRI mostrano edema e infiammazione, oltre alle cellule tumorali e può essere difficile separare l&#39;effetto del trattamento di tumore. Per queste ragioni ottenere accurate misurazioni volumetriche del tumore in crescita può essere una sfida. Bioluminescenza richiede ATP, Quindi solo le cellule tumorali vive contribuire ai dati dimensioni del tumore. Nonostante questo, ci sono alcuni vantaggi a risonanza magnetica se una macchina è disponibile. Le cellule non devono essere etichettati con un pennarello bioluminescenti per essere visualizzate alla risonanza magnetica. La possibilità di visualizzare peri-tumorali edema può essere un vantaggio per alcuni protocolli sperimentali. Un punto di forza di entrambe le tecnologie è che l&#39;utilizzo di uno non esclude l&#39;uso degli altri, quindi i dati possono essere ottenuti sulla crescita del tumore così come la presenza di peri-tumorali edema e infiammazione dello stesso animale, quando le due tecnologie sono disponibili al ricercatore.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o fornitura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> GL261-luc2 Bioware Ultra </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> GL261-luc2 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificato (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10313039 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11811-023 </td><td></td></tr><tr><td> Di siero fetale bovino (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Mice </td><td> NCI-Frederick </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AKWA Tears lubrificante unguento oftalmico </td><td> Akorn Inc </td><td> 17478-062-35 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaset (cloridrato di ketamina) </td><td> Wyeth </td><td> 11570775 </td><td></td></tr><tr><td> Sedazine (cloridrato xilazina) </td><td> Wyeth </td><td> 10031894 </td><td></td></tr><tr><td> Piccoli Animali Strumento Stereotassica </td><td> Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump con SYS-Micro4 controller </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> UMP3-1 </td><td> Se non disponibile, è possibile infondere manualmente </td></tr><tr><td> Siringa 10μl con 26 gauge smussato aghi </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> SGE010RNS </td><td></td></tr><tr><td> Adison Pinza </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500092 </td><td></td></tr><tr><td> Penfield Dissector </td><td> Codman </td><td> 65-1015 </td><td></td></tr><tr><td> 16g 1 ½ di precisione Glide Needle </td><td> Beckton, Dickinson and Company (BD) </td><td> 305198 </td><td></td></tr><tr><td> Lama maniglia chirurgico </td><td> BD </td><td> 371030 </td><td></td></tr><tr><td> Taglia 15 Lama </td><td> BD </td><td> 371315 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 sutura Vicryl </td><td> Ethicon </td><td> VCP496G </td><td></td></tr><tr><td> Bone Wax </td><td> Medline </td><td> DYNJBW25 </td><td></td></tr><tr><td> Povidine Iodio-tampone Sticks </td><td> Medline </td><td> MD93901 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin Potassio Salt </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Foraneo (isoflurano) </td><td> Baxter </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> OPMI Pentero Microscopio </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td> Ogni microscopio operatorio sarà sufficiente </td></tr><tr><td> Xenogen Spectrum IVIS con sistema di anestesia opzionale </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas

Il mouse glioma 261 (GL261) è riconosciuto come un sistema di modello in vivo che riassume molte delle caratteristiche del glioblastoma multiforme umano (GBM). La linea cellulare è stata originariamente indotta da iniezione intracranica di 3-metil-cholantrene in un C57BL / 6 ceppo di topi singenici 1; quindi, immunologicamente competenti C57BL / 6 topi possono essere utilizzati. Mentre usiamo GL261, il seguente protocollo può essere utilizzato per l&#39;impianto e il monitoraggio di qualsiasi modello intracranica del tumore del mouse. GL261 cellule sono state progettate per esprimere stabilmente lucciola luciferasi (GL261-luc). Abbiamo anche creato la più brillante GL261-luc2 linea cellulare di trasfezione stabile del gene luc2 espressa dal promotore CMV. Topi C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (variante albino di C57BL / 6) dal National Cancer Institute, Frederick, MD sono stati utilizzati per eliminare l&#39;attenuazione della luce causata da pelle nera e pelliccia. Con l&#39;uso di C57BL albino / 6 topi, imaging in vivo utilizzando la Spectrum IVIS in vivo iml&#39;invecchiamento del sistema è possibile dal giorno di impianto (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Il GL261 e GL261-luc-luc2 linee cellulari hanno mostrato lo stesso comportamento in vivo come genitori GL261 cellule. Alcune delle caratteristiche istologiche condivise presenti nel GBM umano e questo modello di topo sono: necrosi tumorale, pseudopalisades, neovascolarizzazione, invasione, ipercellularità, e l&#39;infiammazione 1. Prima di animali l&#39;impianto sono stati anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg / kg), xilazina (5 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mg / kg), inserito in un apparato stereotassico e una incisione è stata fatta con un bisturi il linea mediana del cranio. Un burrhole è stata fatta posteriore 0,1 millimetri al bregma e 2,3 millimetri a destra della linea mediana. Un ago è stato inserito ad una profondità di 0.4mm 3mm ritirato ad una profondità di 2,6 mm. Due ml di GL261-luc o GL261-luc2 cellule (10 7 cellule / ml) sono state infuse nel corso di 3 minuti. Il burrhole è stato chiusobonewax e con l&#39;incisione è stata suturata. In seguito l&#39;impianto stereotassico le cellule bioluminescenti sono rilevabili dal giorno di impianto e il tumore può essere analizzato utilizzando la funzione di ricostruzione delle immagini 3D dello strumento Spectrum IVIS. Gli animali ricevono una iniezione sottocutanea di 150 mg luciferina / kg di peso corporeo 20 minuti prima di imaging. Massa tumorale è quantificato mediante bioluminescenza medio del tumore nel tempo. Portatori di tumore nei topi sono stati osservati quotidianamente per valutare la morbilità e sono stati sacrificati quando uno o più dei seguenti sintomi sono presenti: letargia, incapacità di deambulare, la postura ingobbita, il mancato sposo, anoressia con conseguente perdita&gt; 10% del peso. I tumori sono stati evidenti in tutti gli animali della necroscopia.

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Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Impianto intracranico di GL261 cellule in C57BL / 6 topi produce gliomi maligni che ricapitolano molte delle caratteristiche del glioblastoma multiforme umano. Abbiamo usato GL261 cellule che esprimono stabilmente luciferasi per permetterci di utilizzare<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging per seguire la progressione del tumore. L&#39;intervento e 3D<em&gt; In vivo</em&gt; Immagini sono dimostrati.

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

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