Name: intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas
Uploaded: 2011-11-06T14:00:00
Duration: 9 min 46 s
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Nós gostaríamos de agradecer o Dr. Joshua B. Rubin pelo dom generoso de os plasmídeos para o sistema de lentivírus, assim como Rao Mahil para sugestão útil na preparação das células GL261-luc. Agradecemos a Estudantes Apoio à Pesquisa do tumor cerebral (SSBTR), The Barrow Neurological Foundation e da Fundação Wallace, por seu apoio generoso. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use do Hospital São José e Centro Médico.

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	<li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li><li>Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. i. m., Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ketogenic+diet+reverses+gene+expression+patterns+and+redudes+reactive+oxygen+species+levels+when+used+as+an+adjuvant+therapy+for+glioma.">The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma.</a> Nutr Metab. 7, (2010).</li><li>Caliper Life Sciences, Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems. , (2010).</li><li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+are+essential+for+priming+but+inefficient+for+boosting+antitumour+immune+response+in+an+orthotopic+murine+glioma+model.">Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model.</a> Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).</li></ol>

Acesso livre para este artigo é patrocinado pela Caliper Life Sciences.

O inóculo de células é infundida a uma profundidade de 2,6 mm da superfície do cérebro depois de criar uma bolsa de 0,4 mm. Para assegurar a colocação adequada e profundidade da agulha um raio-X pode ser tomada através de um C-Arm ou outro dispositivo de imagem semelhante de raios-X intensificando, no entanto, este é opcional. Complicações da cirurgia podem surgir se o animal não está devidamente sedado, altura em que o animal pode se mover durante a infusão de células. Isto pode causar vazamento de mistura de células ou sangramento da trilha da agulha. Vazamento de células provoca o crescimento de células tumorais ectópica. Também é importante para não perfurar o ventrículo o que pode ser feito se o burrhole medial é feita para o 2,3 mm descritos no protocolo 4. Colocação adequada da propagação agulha e celular foi testada através da infusão de um mouse com 2 mL azul de metileno e dissecando o tecido cerebral para verificar a localização do corante infundida. Neste protocolo temos utilizado a Spectrum IVIS in vivo imagens de sistema e tele Vivendo software de imagem (v 4.0) projetado para uso com este instrumento. (Caliper Life Sciences). Qualquer comparável in vivo do sistema de imagem e ferramentas de análise de imagem pode ser usada para obter resultados semelhantes. Estes sistemas oferecem algumas vantagens sobre a ressonância tradicional magnética (MRI) para acompanhar o crescimento de um tumor experimental intracraniana. O mais óbvio é o custo relativo dos dois instrumentos - máquinas de ressonância magnética animais são muito mais caros e, normalmente, necessitam dos serviços de um técnico especializado MRI. In vivo de imagens, como o que foi descrito aqui pode ser feito pelo usuário final. Os dados bioluminescência é quantitativa, enquanto quantificação de dados de MRI é demorado e um pouco inexata. Além disso, imagens de ressonância magnética mostram edema e inflamação, além de células tumorais e pode ser difícil separar tumor do efeito do tratamento. Por estas razões a obtenção de medições precisas volumétrica do tumor em crescimento pode ser um desafio. Bioluminescência requer ATP, Portanto somente as células tumorais que vivem contribuir para os dados de tamanho do tumor. Apesar disso, existem algumas vantagens de MRI se uma máquina está disponível. As células não precisam ser rotulados com um marcador bioluminescente para ser visualizado por MRI. A capacidade de visualizar peri-tumoral edema pode ser uma vantagem para alguns protocolos experimentais. A força das duas tecnologias é que o uso de uma não exclui a utilização do outro, portanto os dados podem ser obtidos no crescimento do tumor, bem como a presença de peri-tumoral edema e inflamação do mesmo animal, quando as duas tecnologias estão disponíveis para o pesquisador.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou fornecimento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> GL261-luc2 Bioware Ultra </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> GL261-luc2 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado Dulbecco Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10313039 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11811-023 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato Buffered Saline (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> Ratos C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr </td><td> NCI-Frederick </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lágrimas AKWA Pomada Oftálmica Lubrificante </td><td> Akorn Inc </td><td> 17478-062-35 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaset (cloridrato de cetamina) </td><td> Wyeth </td><td> 11570775 </td><td></td></tr><tr><td> Sedazine (cloridrato de xilazina) </td><td> Wyeth </td><td> 10031894 </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento estereotáxica Pequenos Animais </td><td> Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump com SYS-MICRO4 Controlador </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> UMP3-1 </td><td> Se não estiver disponível, é possível para infundir manualmente </td></tr><tr><td> 10μl seringa com 26 gauge agulha chanfrada </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> SGE010RNS </td><td></td></tr><tr><td> Adison Pinça </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 500092 </td><td></td></tr><tr><td> Penfield Dissector </td><td> Codman </td><td> 65-1015 </td><td></td></tr><tr><td> 16g 1 ½ Precision Glide Needle </td><td> Beckton, Dickinson and Company (BD) </td><td> 305198 </td><td></td></tr><tr><td> Cabo da lâmina cirúrgica </td><td> BD </td><td> 371030 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmina tamanho 15 </td><td> BD </td><td> 371315 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura Vicryl 4-0 </td><td> Ethicon </td><td> VCP496G </td><td></td></tr><tr><td> Cera de osso </td><td> Medline </td><td> DYNJBW25 </td><td></td></tr><tr><td> Iodo-povidine Sticks Swab </td><td> Medline </td><td> MD93901 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferina sal de potássio </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Forâneo (isoflurano) </td><td> Baxter </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> OPMI Microscópio Pentero </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td> Qualquer microscópio cirúrgico será suficiente </td></tr><tr><td> Xenogen Spectrum IVIS com sistema de anestesia opcional </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas

O mouse glioma 261 (GL261) é reconhecido como um sistema modelo in vivo que recapitula muitas das características de glioblastoma multiforme humano (GBM). A linhagem de células foi originalmente induzida pela injeção intracraniana de 3-metil-cholantrene em uma linhagem C57BL / 6 do mouse singeneicos 1 e, portanto, imunologicamente competentes camundongos C57BL / 6 pode ser usado. Enquanto usamos GL261, o protocolo a seguir podem ser usados ​​para a implantação e monitoramento de qualquer modelo de mouse intracraniana tumor. GL261 células foram projetadas para expressar estavelmente firefly luciferase (GL261-luc). Criamos também o mais brilhante linha GL261-luc2 celular por transfecção estável do gene luc2 expressa do promotor CMV. Camundongos C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (variante albina de C57BL / 6) do National Cancer Institute, Frederick, MD foram utilizados para eliminar a atenuação da luz causada por pele negra e pele. Com o uso de C57BL albino / 6 ratos; em imagem in vivo utilizando o espectro IVIS in vivo imo envelhecimento do sistema é possível a partir do dia da implantação (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). O GL261 e GL261-luc-luc2 linhagens celulares mostraram o mesmo comportamento em vivo como o dos pais GL261 células. Algumas das características compartilhadas histológico presente em GBMS humano e este modelo de camundongo incluem: necrose tumoral, pseudopalisades, neovascularização, invasão, hipercelularidade e inflamação 1. Antes da implantação animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de cetamina (50 mg / kg), xilazina (5 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mg / kg), colocado em um aparelho estereotáxico e foi feita uma incisão com um bisturi sobre o linha média do crânio. A burrhole foi feito posterior ao bregma 0,1 milímetros e 2,3 milímetros para a direita da linha média. A agulha foi inserida a uma profundidade de 0,4 milímetros de 3mm e retirado a uma profundidade de 2,6 milímetros. Dois mL de GL261-luc ou GL261-luc2 células (10 7 células / ml) foram infundidos ao longo de três minutos. O burrhole foi fechadacom bonewax ea incisão foi suturada. Após a implantação estereotáxica as células bioluminescentes são detectáveis ​​a partir do dia da implantação e do tumor podem ser analisadas usando o recurso de reconstrução de imagem 3D do instrumento IVIS Spectrum. Animais recebem uma injeção subcutânea de 150μg luciferina / kg de peso corporal 20 min antes da imagem. Carga tumoral é quantificado usando bioluminescência médio do tumor ao longo do tempo. Tumor-rolamento camundongos foram observados diariamente para avaliar a morbidade e foram sacrificados quando um ou mais dos seguintes sintomas estão presentes: insuficiência letargia, de deambular, postura arqueada, a falta de noivo, resultando em anorexia&gt; perda de 10% do peso. Os tumores eram evidentes em todos os animais em necropsia.

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Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Implantação intracraniana de GL261 células em camundongos C57BL / 6 produz gliomas malignos que recapitulam muitas das características de glioblastoma multiforme humano. Usamos GL261 células expressando estavelmente luciferase para nos permitir usar<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem para acompanhar a progressão do tumor. A cirurgia e 3D<em&gt; In vivo</em&gt; Imagens são demonstradas.

Implantação intracraniana com 3D subseqüentes In Vivo Bioluminescent imagem de Gliomas murino

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

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Medicina

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Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

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Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

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Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

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A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

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Murino Endoscopia para<em&gt; In Vivo</em&gt; Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

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The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

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Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...