Name: intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas
Uploaded: 2011-11-06T14:00:00
Duration: 9 min 46 s
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Nos gustaría agradecer al Dr. Joshua B. Rubin por el generoso regalo de los plásmidos para el sistema de lentivirus, así como Rao Mahil por sugerencia útil en la preparación de las células GL261-luc. Agradecemos a los estudiantes Apoyo a la investigación del tumor cerebral (SSBTR), la Fundación Neurológica Barrow y la Fundación Wallace por su generoso apoyo. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de Hospital St. Joseph y el Centro Médico.

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	<li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li><li>Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. i. m., Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ketogenic+diet+reverses+gene+expression+patterns+and+redudes+reactive+oxygen+species+levels+when+used+as+an+adjuvant+therapy+for+glioma.">The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma.</a> Nutr Metab. 7, (2010).</li><li>Caliper Life Sciences, Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems. , (2010).</li><li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+are+essential+for+priming+but+inefficient+for+boosting+antitumour+immune+response+in+an+orthotopic+murine+glioma+model.">Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model.</a> Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).</li></ol>

Acceso libre a este artículo es patrocinado por Caliper Life Sciences.

El inóculo de células se infunde a una profundidad de 2,6 mm de la superficie del cerebro después de la creación de una bolsa de 0,4 mm. Para asegurar la colocación adecuada y la profundidad de la aguja de una radiografía se puede tomar con un brazo-C o similar de rayos X de dispositivos de imagen intensificando, sin embargo, esto es opcional. Las complicaciones de la cirugía pueden surgir si el animal no está adecuadamente sedado, momento en el que el animal puede moverse durante la infusión de células. Esto puede causar fugas de la mezcla de células o sangrado de trayecto de la aguja. La fuga de las células causa el crecimiento ectópica de las células tumorales. También es importante no perforar el ventrículo que se puede hacer si el burrhole se hace por dentro de la de 2,3 mm se describe en el protocolo 4. La colocación correcta de la aguja y propagación de células se puso a prueba mediante la infusión de un ratón con dos l colorante azul de metileno y la disección de los tejidos cerebrales para verificar la ubicación del colorante infundido. En este protocolo se ha utilizado el espectro IVIS de imágenes in vivo del sistema y tque estar de software de imagen (v 4.0), diseñado para su uso con este instrumento. (Caliper Life Sciences). Cualquier sistema de imagen comparable en vivo y herramientas de análisis de imagen se puede utilizar para obtener resultados similares. Estos sistemas ofrecen algunas ventajas sobre las tradicionales imágenes por resonancia magnética (MRI) para seguir el crecimiento de un tumor intracraneal experimental. El más obvio es el costo relativo de los dos instrumentos - máquinas de resonancia magnética de los animales son mucho más caros y suelen requerir los servicios de un técnico de MRI especializada. Imágenes in vivo, como lo que se describe aquí se puede hacer por el usuario final. Los datos de la bioluminiscencia es cuantitativo, mientras que la cuantificación de los datos de la RM es mucho tiempo y un poco inexacta. Además, imágenes de resonancia magnética muestran edema y la inflamación, además de las células tumorales y puede ser difícil separar el efecto del tratamiento de tumores. Por estas razones, la obtención de precisas mediciones volumétricas del crecimiento del tumor puede ser un desafío. Bioluminiscencia requiere ATP, Por lo tanto, sólo las células tumorales de vida contribuyen a los datos del tamaño del tumor. A pesar de esto, hay algunas ventajas de la RM, si una máquina está disponible. Las células no tienen que estar etiquetados con un marcador bioluminiscente a visualizar por resonancia magnética. La capacidad de visualizar el edema peri-tumoral puede ser una ventaja para algunos protocolos experimentales. Una de las ventajas de ambas tecnologías es que el uso de uno no excluye el uso de la otra, por lo que se pueden obtener datos sobre el crecimiento del tumor, así como la presencia de peri-tumoral edema y la inflamación del mismo animal, cuando ambas tecnologías están disponibles para el investigador.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o el suministro </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> GL261-luc2 Bioware ultra </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> GL261-luc2 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10313039 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticina (G418) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11811-023 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Ratones </td><td> NCI-Frederick </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AKWA lágrimas lubricantes oftálmicos pomada </td><td> Akorn Inc </td><td> 17478-062-35 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaset (clorhidrato de ketamina) </td><td> Wyeth </td><td> 11570775 </td><td></td></tr><tr><td> Sedazine (clorhidrato de xilazina) </td><td> Wyeth </td><td> 10031894 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeños Animales de instrumentos estereotáxica </td><td> Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump con SYS-Micro4 Controller </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> UMP3-1 </td><td> Si no está disponible, es posible inyectar manualmente </td></tr><tr><td> 10μl jeringa con aguja de calibre 26 biselados </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> SGE010RNS </td><td></td></tr><tr><td> Adison Pinzas </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 500092 </td><td></td></tr><tr><td> Penfield disector </td><td> Codman </td><td> 65-1015 </td><td></td></tr><tr><td> 16 g 1 ½ precisión Glide aguja </td><td> Beckton Dickinson and Company (BD) </td><td> 305198 </td><td></td></tr><tr><td> Manejar la hoja quirúrgica </td><td> BD </td><td> 371030 </td><td></td></tr><tr><td> Tamaño de la hoja 15 </td><td> BD </td><td> 371315 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura Vicryl 4-0 </td><td> Ethicon </td><td> VCP496G </td><td></td></tr><tr><td> La cera de hueso </td><td> Medline </td><td> DYNJBW25 </td><td></td></tr><tr><td> Yodo povidona palillos de hisopo </td><td> Medline </td><td> MD93901 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferina de sal de potasio </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Foráneo (isoflurano) </td><td> Baxter </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> OPMI Pentero Microscopio </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td> Cualquier microscopio quirúrgico es suficiente </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS del espectro con el sistema opcional de la anestesia </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas

El ratón glioma 261 (GL261) es reconocido como un sistema en el modelo in vivo que resume muchas de las características del glioblastoma multiforme humano (GBM). La línea celular fue inducida inicialmente por inyección intracraneal de 3-metil-cholantrene en un C57BL / 6 cepa de ratón singénico 1, por lo tanto, inmunocompetentes ratones C57BL / 6 se puede utilizar. Mientras que utilizamos el GL261, el siguiente protocolo se puede utilizar para la implantación y seguimiento de cualquier modelo de ratón de tumores intracraneales. GL261 células fueron diseñados para expresar de forma estable la luciferasa de luciérnaga (GL261-luc). También hemos creado el más brillante GL261-luc2 de líneas celulares mediante transfección estable del gen luc2 expresa del promotor de CMV. Ratones C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (variante albina de C57BL / 6) del Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, MD se utiliza para eliminar la atenuación de la luz causada por la piel y el pelo negro. Con el uso de C57BL albino / 6 ratones; imágenes in vivo utilizando el espectro IVIS en vivo imel envejecimiento del sistema es posible a partir del día de la implantación (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). El GL261-luc y GL261-luc2 líneas celulares mostraron el mismo comportamiento in vivo como la de sus padres GL261 células. Algunas de las características compartidas histológicos presentes en GBMs humanos y este modelo de ratón son: necrosis tumoral, pseudopalisades, la neovascularización, la invasión, hipercelularidad, y la inflamación 1. Antes de la implantación de los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg / kg), xilacina (5 mg / kg) y buprenorfina (0,05 mg / kg), colocado en un aparato estereotáctico y una incisión se realizó con un bisturí sobre la la línea media del cráneo. A burrhole se hizo posterior a la de 0,1 mm y 2,3 mm bregma a la derecha de la línea media. Una aguja se inserta a una profundidad de 0,4 mm y 3 mm de retirarse a una profundidad de 2,6 mm. Dos l de GL261-luc o GL261-luc2 células (10 7 células / ml) fueron infundidos en el transcurso de 3 minutos. El burrhole se cerrócon bonewax y la incisión fue suturada. Tras el implante estereotáctico de las células bioluminiscentes son detectables a partir del día de la implantación y el tumor puede ser analizada utilizando la función de reconstrucción de imágenes 3D de los instrumentos de espectro IVIS. Los animales reciben una inyección subcutánea de 150μg luciferina / kg de peso corporal de 20 minutos antes de la imagen. La carga tumoral se cuantifica utilizando bioluminiscencia tumor significa que el paso del tiempo. Los ratones portadores del tumor fueron observados diariamente para evaluar la morbilidad y fueron sacrificados cuando uno o más de los siguientes síntomas están presentes: letargo, falta de deambular, postura encorvada, falta de novio, anorexia resulta en la pérdida&gt; 10% del peso. Los tumores fueron evidentes en todos los animales en la necropsia.

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Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Implantación intracraneal de GL261 células en ratones C57BL / 6 produce los gliomas malignos que recapitular muchas de las características del glioblastoma multiforme humano. Hemos utilizado GL261 células que expresan establemente la luciferasa que nos permita utilizar<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para seguir la progresión del tumor. La cirugía y 3D<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes se muestran.

La implantación intracraneal con posterioridad 3D En Vivo Bioluminiscentes imagen de gliomas murino

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

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Murino hepática Bioluminiscente modelo tumoral

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

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La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

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