Name: intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas
Uploaded: 2011-11-06T14:00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas at JoVE.com

Vi vill tacka för Dr Joshua B. Rubin för den generösa gåvan av plasmider för lentivirus systemet samt Mahil Rao för bra förslag på förberedelserna inför GL261-luc celler. Vi tackar Studenter stödja forskning hjärntumör (SSBTR), The Barrow Neurological Foundation och The Wallace Foundation för deras generösa stöd. Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén för St Josephs Hospital och Medical Center.

1. Cell Culture <ol><li> Den GL26 cellinje erhölls från Avdelningen för cancerbehandling och diagnostik (DCTD) National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD. För att underlätta en kvantitativ mätning av tumörens GL261 tillväxttakt celler gjordes självlysande med Lentiphos HT System (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) med Lenti-X HT Packaging Mix (Clontech Laboratories, Inc.) och FUW- GL plasmid (en generös gåva från laboratoriet över JB Rubin, MD, PhD). Celler bibehölls i Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) med 10% tetracyklin-fri fetalt kalvserum (FCS, Clontech Laboratories, Inc.). GL261 celler var också stabilt transfererats med kodar luc2 med pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] vektor (Promega Corp, Madison, WI) och FuGENE 6 Transfektion Reagent (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) följande villkor som angetts av tillverkaren. Den luc2 genen är ett kodon optimerad version av firefly luciferaSE som ger en betydligt högre ljusflöde än standard luc genen. Stabil transfectants valdes ut och underhållas i DMEM media som innehåller 10% FCS och 100 mikrogram / ml Geneticin (G418, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA). </li><li> Före implantationen de odlade cellerna skördas av trypsinzation, tvättas en gång i DMEM utan serum och suspenderade i DMEM utan serum vid en koncentration på 1 x 10 7 celler / ml. </li></ol> 2. Kirurgi Setup 2 <ol><li> En steril miljö bibehålls under operationen, inklusive alla kirurgiska instrument, tillbehör, handskar, draperier, mm. </li><li> Tio veckor gamla C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (albino C57BL / 6) möss köps från National Cancer Institute vid Frederick Animal Production Program och användas på en genomsnittlig vikt på 20 gram (GNI, Frederick, MD). </li><li> Djur är bedövad efter intraperitoneal injektion av xylazin (5 mg / kg), ketamin (50 mg / kg) och buprenorfin (0,05 mg / kg). För atte nypa görs för att säkerställa att djuret är tillräckligt sövd innan operationen påbörjas. Movement (även om något) av någon del av djuret är ett tecken på en sänkning av anestesi. Animal omedelbart ges ytterligare 3,3 mg / kg xylazin och 26,6 mg / kg ketamin. Kroppstemperaturen upprätthålls med hjälp av en lampa och sterilt förband som täcker kroppen. </li><li> När djuret är ordentligt sövda, placeras de på det mjuka sängen av stereotaktisk headframe (Modell 900 Small Animal Stereotaxic, David Kopf Instruments) [Figur 1]. </li><li> En liten mängd (1 / 4 tum) i AKWA Tears Ophthalmic smörjmedel Salva appliceras över hornhinnor. </li><li> Djuret är säkrad i stereotaktisk ram genom att öppna djurets mun (genom att sätta pekfingret och tummen runt djurets käken) och skjuta den övre framtänderna i fördjupning i stereotaktisk ram. Klämman dras åt för att säkra djurets huvud i headsetet och se till att ee huvud är anpassad och ögonen är centrerade, se dock inte att utöva otillbörliga kraft på djurets huvud. </li><li> O 2 Slangen är tejpade nere vid djurets näsborrar. Syre flödet är 0,5 l / min. </li><li> Den nedre delen av ryggen och svansen är tejpade ner till stereotaktisk sängen försiktigt så att inte kompromissa andetag. </li><li> Det kirurgiska ingreppet platsen är rakat. Povidine-Jod Swab minnen används för att tvätta området mellan ögonen går tillbaka till området mellan öronen med jod och se till att jod inte dropp i djurets ögon. </li><li> Cellerna är förberedda för implantation strax före operationen och regelbundet blandas för att säkerställa att de inte nöja sig. </li><li> En 10 l, är 50 mm World precisionsinstrument (WPI), Sarasota, FL, spruta med 26 gauge avfasade nål laddad med cellen inokulat. Om cellerna verkar vara hopklumpade tillsammans kan det vara nödvändigt att ladda sprutan. </li><li> Den 10 ìl spruta placeras sedan in i UMP3-1 UltramicroPump mikro injektor (WPI, Sarasota, FL). </li></ol> 3. Intrakraniell Implantation 2 <ol><li> Huden snitt görs med hjälp av en storlek 15 skalpell blad och tandade pincett. En 10-15 mm snitt görs i längdriktningen från mellan djurets ögon, rör sig mot djurets öron utsätta bregma (korsningen av sagittala och koronala suturer på toppen av skallen). Var noga med att korrekt identifiera bregma för den lätt kan förväxlas med sinus område som är distalt om bregma [Figur 2]. </li><li> När djuret är nedsövd den får en inom incisional injektion på 0,25% (2,5 mg / ml) bupivakain. </li><li> En burrhole görs 0,1 mm posteriort bregma och 2,3 mm till höger om mittlinjen genom att långsamt vrida en 16 gauge 1 ½ tum nål för hand, tillämpa lite tryck på nålen samtidigt vrida tills skallen penetreras och hjärnan utsätts för. </li><li> Sprutnålen flyttas ner i position med hjälp av Microdrive stereotactic spruta hållaren tills det når bara hjärnans yta. Från denna position, är nålen avancerade in i hjärnan till ett djup av 3 mm och hålls på plats under 3 minuter. </li><li> Nålen dras 0,4 mm till ett totalt djup av 2,6 mm under ytan av hjärnan och skapar en liten ficka där cellerna ska infunderas. Det är valfritt vid denna tidpunkt att ta en röntgenbild av nålen i djuret för att säkerställa korrekt placering och djup. </li><li> Cellsuspensionen infunderas under 3 minuter med mikro injektorn inställd på en volym av 2000 nL (2 mikroliter) med en infusionshastighet på 667 NL / minut. </li><li> Kanylen sitter kvar på plats för 2 minuter för att förhindra läckage från infusionsstället. </li><li> Nålen är långsamt tillbaka helt. </li><li> Den burrhole är fylld med ben vax med en Penfield DISSEKTOR. </li><li> Snittet sys med en 4-0 (1,5 Metric) vicryl sutur som gör att inga stora luckor finns kvar i huden. Vicryl är en suturmaterial som löses upps, och därför suturer behöver inte tas bort när snittet är läkt. </li><li> Efter operation att djuren placeras i en bur under en värme lampa som är inställd på önskad höjd för att värma botten yta på buren till 30 ° C. När djuren är helt vaken (som bedöms av normal rörlighet i buren) är de tillbaka till gruppboenden. Muntlig ibuprofen läggs till sitt dricksvatten under 5 dagar postoperativt. 100 mg av barns ibuprofen (100mg/5ml) läggs till en standard 473 ml gnagare vattenflaska. Observeras djuren dagligen och avbildas och vägde var 3 dagar. Två veckor efter implantation observation ökas till två gånger per dag. Djur avlivas när de visar tecken på sviktande hälsa som inkluderar krökt kroppshållning, nedsatt rörlighet och synliga viktminskning (≥ 20%). Dessa symtom är ett publicerat svar på tumören och de reproducerbart visas cirka 1 dag före döden på grund av tumören. </li></ol> 4. In vivo </em&gt; bioluminescence Imaging 3 <ol><li> Starta [Bild Living] programvara. </li><li> Den IVIS Imaging System initieras genom att klicka på [Initialize IVIS System] knappen längst ner till höger på kontrollpanelen. </li><li> Välj [Luminescent] Imaging Mode på den övre vänstra sidan av kontrollpanelen. </li><li> För att bestämma den optimala tiden för avbildning efter luciferin injektion en kinetisk studie är nödvändig [Figur 3]. Denna beskrivning är för Firefly luciferas; <ol class="lalpha"><li> Injicera 10μl / g kroppsvikt D-luciferin eldfluga (15mg/ml i PBS, Caliper Life Sciences Katalog XR-1001 eller en liknande produkt från en annan leverantör) i djuret, som beskrivs nedan. </li><li> Vänta 3 minuter och sedan söva musen genom att placera in det i gasen anestesi kammare (2% isofluran gas i O 2). </li><li> Stäng av gasen anestesi till kammaren och öppna anestesi ventilen och vakuum till IVIS grenröret. Placera omedelbart lugnande djuretpå temperaturkontrollerade imaging plattform och se till att musens näsborren är korrekt placerad i gasen anestesi grenröret. Den första bilden ska tas med ca 5 minuter efter luciferin injektionen. Upp till 5 djur kan avbildas på en gång i IVIS Spectrum instrumentet. Om mindre än fem djur skall avbildas, är det möjligt att koppla in oanvända grenrör (s) för att spara på isofluran gas. </li><li> Fortsätt att ta bilder varje 3 minuter genom att skapa en sekvens för upp till en timme för att skapa en kinetisk kurva för luciferin uttryck. <ol><li> Klicka på [Sequence Setup]-knappen i kontrollpanelen. </li><li> Sekvensen redaktör visas. </li><li> I kontrollpanelen, ange inställningar för den första självlysande bilden i sekvensen. <ol class="lroman"><li> Vi rekommenderar att börja med Medium Binning. </li><li> Vi rekommenderar också automatisk exponering för att avgöra optimal exponering tiden. </li><li> Välj [Fördröjning]-knappen i sekvensen editorn ennd ange en fördröjning på 3 minuter mellan varje förvärv. </li></ol></li><li> Klicka på [Lägg till] i sekvensen redaktör. Förvärv parametrar läggs därefter till i tabellen. </li><li> Upprepa steg 4 för varje bild i sekvensen. </li></ol></li><li> När kurvan är etablerad kan den optimala avbildning tid bestämmas genom att rita signalstyrkan (intensitet) som funktion av tiden. Bild djur vid tidpunkten för högsta in vivo fotonen räkna för att få den starkaste och mest exakta signal. </li></ol></li><li> Tidiga experiment används intraperitoneal (ip) injektion av luciferin, resulterade dock ip injektioner ibland i intermittent resultat som visar liten eller ingen mareld i tumören. Vi antar att enstaka slumpmässiga avsaknaden av signalen berodde på leverans av luciferin till tarm eller andra inre organ. Vi började därför använda subkutan (sc) luciferin injektioner och såg större avbildning reproducerbarhet [Figur 3]. </li><li> Tjugominuter efter subkutan injektion skall djuren bedövas genom att placera dem i en kammare med 2% isofluran gas i O 2 tills de svarar inte. </li><li> Den sövda djur (s) flyttas till avbildning kammaren. Oftalmologiska salva bör användas för den kinetiska studier på grund av längden på avbildning. Det behövs inte för de andra imaging förfaranden för att de är kortvariga. </li><li> Bilden förvärvas på medellång binning med en 5 minuters exponeringstid. Den automatiska förvärvet alternativet kan också användas. </li><li> Om signalen är mättad och / eller svimmar på medelhög binning kan binning eller exponeringstiden justeras. </li><li> Programfilerna och efterföljande kommentarer bilden sparas i användarens dator katalog. </li></ol> 5. 3D Imaging 3 <ol><li> Klicka på [Imaging Wizard] fliken i [Sequence Setup] fönstret på kontrollpanelen. </li><li> Välj [mareld] bildhantering läge på Imaging Wizard startskärmen och CLick [Nästa]. </li><li> I &quot;mareld - DLIT&quot; fönster av imaging guiden, välj [Firefly] reporter sond. Emissionen / excitation av den valda Firefly källan spektrum kommer att visas med de sex som motsvarar filtret val som skall förvärvas. </li><li> Den sista fönster visas med standard val som finns är Auto exponeringsparametrarna förvärv och en av Synfält C. Standardinställningar fungerar mycket bra, men kan dessa inställningar ändras vid behov. </li><li> Klicka på [Nästa] och sekvensen redaktör fönster kommer att befolkas med uppräkning av sex spektrala regioner på 20 nm breda filter (560 nm, 580 nm, 600 Nm, 620 nm, 640 nm och 660nm). Tryck på [Hämta Sequence]. Det första filtret (560 nm) kommer att innehålla ett strukturerat ljus mönster med hjälp av en laser galvanometer att etablera yttopografi. </li><li> Välj [Topografi Surface] fliken i verktygspaletten. Surface utjämning kan tillämpas på kontot för alla skarpa vinklar som skapats under återuppbyggnadsprocessen. Denstandard låg utjämning rekommenderas. </li><li> Klicka på [Skapa] och tomografi analysen visas. Rita en beskärningsruta som omfattar hela djuret och klicka på [Nästa]. </li><li> Tröskeln Verktyget kommer att visas som en lila mask över det valda området. Masken bör automatiskt ställas in för att matcha bilden av djuret. Om nödvändigt, justera tröskeln masken för att mer korrekt passa konturen av djuret. </li><li> Klicka på [Slutför] och rekonstruerade mesh visas. Rekonstruktionen kan sedan sparas i fliken Resultat. </li><li> Efter bildandet av djurets ytans topografi, gå vidare till [DLIT 3D-rekonstruktion] falla ner på verktygspaletten. </li><li> Enligt [Analysera]-fliken väljer du alla sex våglängder för att utföra återuppbyggnaden. Avmarkera bilder som gav mättat pixlar eller punkter under 600. Låt inställningarna i [parametrar] fliken som standard. </li><li> Enligt [Egenskaper] fliken bör &quot;Muscle&quot; att visas som standard val förr Tissue Egenskaper och &quot;Firefly&quot; bör anges som källa spektrumet. </li><li> Klicka på [Rekonstruera] under Analysera fliken och 3D-rekonstruktion av djurets yta och motsvarande ombyggnad av signalkällan ska visas [Bild 4]. </li><li> För att bestämma signalen läge och intensitet, välj voxlar knappen på 3D-fliken Verktyg i verktygspaletten. <ol><li> Rita en fyrkant runt alla visade voxlar och det totala flödet mätningarna visas i botten på fliken Volym. </li><li> Klicka på [masscentrum] för att identifiera signalen platsen där valt voxlar. Koronalt sagittal och tranaxiellt skivor av djuret kommer att visas och använda [Display Measurement Markör] avståndet från djurets yta till Voxel centrum kan mätas. </li></ol></li><li> Se Living bildbehandlingsprogram bruksanvisning för ytterligare information om samtidig registrering av orgel atlaser och andra avancerade funktioner. </li></ol> 6. Data AANALYS 3 <ol><li> När bilden förvärvas och sparas, tillgång till programmet filen genom att klicka på [Bläddra]-knappen och välja filen. </li><li> Bilden information finns under [Visa] → [Bild Information]. </li><li> Intensiteten i signalen kan kvantifieras genom att välja regionen av intresse (ROI) [ROI Tools] knappen. Se till att bilden analyseras under [Photon]-läge genom att välja &quot;Photon&quot; på rullgardinsmenyn i det övre vänstra hörnet av bilden kontrollpanelen. </li><li> Välj [Mätning ROI] knappen från &quot;Typ&quot; rullgardinsmenyn. Välj ROI form av intresse, alternativ är Circle, Square och eller Ikoner. Omfattar alla områden av intensitet på den förvärvade bilden. </li><li> ROI läge ställs in genom att dra ROI formen valet till regionen innehåller självlysande signalen. </li><li> Signalen intensitet ROI beräknas genom att klicka på [Mät] knappen. ROI Etiketten visar intensitet. ROI är kan hanteras och sparas USIng den Levande bildbehandlingsprogram. </li></ol> 7. Representativa resultat: Framgångsrik cell implantation är uppenbart vid implantation celler detekteras med hjälp av IVIS spektrum på operationsdagen. Både GL261-Luc och GL261-luc2 celler är detekterbar, kommer dock luc2 genen ger en högre grad av mareld [Figur 5]. Bilder tagna strax efter implantation kan ha icke-specifik signal på djurens tassar och nos som bör lämnas utan avseende som bakgrund. Signal ligger vid implantationsstället är verkligt och signalen kommer att öka med tiden [Figur 6]. Nedgången i signalstyrka på dag 6 är reproducerbara och troligen på grund av förlust av tumören ta av några av de implanterade cellerna. Kvantitativa mätningar av tumörbörda är reproducerbara i det att de bör öka stadigt tills djuret till slut dukar under för sjukdomen. Dock kommer tillväxtkurvor beror till stor del om tillståndet i implanterade celler, och eller oundvikliga mindre var<html> iability i implantationen förfarande. Vårt laboratorium har valt att bilden implanterade djuren var tredje dag. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig1.jpg" /> Figur 1. När musen är ordentligt sövda är det placeras i stereotaktisk ram. Musen huvudet säkras med hjälp av munnen klämman. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig2.jpg" /> Figur 2. Efter att huden öppnas de viktigaste anatomiska landmärken identifieras bland annat inkluderar bregma, den koronala och sagittalt suturer. Den burrhole görs 2.3mm till höger om bregma genom att långsamt vrida en 16 gauge 1 ½ tum nål med ett litet tryck tills skallen penetreras och hjärnan utsätts för. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig3.jpg" /> Figur 3. En kinetisk jämförelse av subkutan (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg &quot;alt =&quot; Figure3.1 &quot;/&gt;) kontra intraperitoneal ( <img src="/files/ftp_upload/3403/3403fig3_2.jpg" alt="Figure3.2" /> ) Luciferin injektion utfördes för att demonstrera nyttan av en subkutan luciferin injektion och för att identifiera den optimala tiden för att bilden efter luciferin administration. Tre minuter efter luciferin injicerades musen blev drogad, placerad i IVIS Spectrum instrumentet och avbildade var 3 minuter upp till en timme och var 6 minuter efter att generera en kinetisk kurva för bioluminescens. Detta visade att en Subkutan luciferin administrationen var överlägsen en intraperitoneal injektion i våra händer, och att den optimala tiden för att bilden djuren var cirka 25 minuter efter luciferin injektion GL261-luc celler användes. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig4.jpg" /> Figur 4. Flera vyer av en 3-dimensionell reconstBRÅK av intrakraniell implantation av GL261-luc2 celler co-registrerade med musen skelettet och hjärnan. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig5.jpg" /> Figur 5. Photon räknas från tumörer till följd av GL261-luc celler vs GL261-luc2 celler. Resultaten är ett genomsnitt av 5 djur. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3403/3403fig6.jpg" /> Figur 6. Graf för GL261-Luc tumör celltillväxt i en albino C57BL / 6 mus. Bioluminescence mättes var 3 dagar och ritas som in vivo fotonen räkna kontra dagar efter implantation. Fotografier visar bioluminescence vid olika tidpunkter. Färgning är ett tecken på mareld (pixel intensitet) som är relativt till tumörceller nummer (färgfält visas till höger). Efter att djuret dukade under för sjukdomen hjärnan var dissekeras och luciferin lades lokalt för att få ex vivo image bilden infällda.

<ol>
	<li>Candolfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathological+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).</li><li>Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. i. m., Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ketogenic+diet+reverses+gene+expression+patterns+and+redudes+reactive+oxygen+species+levels+when+used+as+an+adjuvant+therapy+for+glioma.">The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma.</a> Nutr Metab. 7, (2010).</li><li>Caliper Life Sciences, Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems. , (2010).</li><li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+are+essential+for+priming+but+inefficient+for+boosting+antitumour+immune+response+in+an+orthotopic+murine+glioma+model.">Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model.</a> Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).</li></ol>

Fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Caliper Life Sciences.

Cellen inokulatet infunderas på ett djup av 2,6 mm från ytan av hjärnan efter att skapa en 0,4 mm ficka. För att säkerställa korrekt placering och djup nål en röntgenbild kan tas med hjälp av en C-båge eller liknande röntgenbild intensifiera enhet, men det är valfritt. Komplikationer av operationen kan uppstå om djuret inte är ordentligt sövd, varvid djuret kan röra sig under cellen infusion. Detta kan orsaka läckage av celler mix eller blödning från nål spår. Läckage av celler som orsakar ektopisk tillväxt av tumörceller. Det är också viktigt att inte punktera kammare som kan göras om burrhole görs mediala till 2,3 mm beskrivs i protokollet 4. Korrekt placering av nålen och cell sprids testades genom att ingjuta en mus med 2 l metylenblått färg och dissekera hjärnvävnaden att kontrollera placeringen av infunderas färgämne. I detta protokoll har vi använt IVIS Spectrum in vivo imaging system och tHan Living bildbehandlingsprogram (v 4,0) utformad för användning med detta instrument. (Caliper Life Sciences). Alla jämförbara in vivo imaging system och image analysverktyg kan användas för att uppnå liknande resultat. Dessa system ger några fördelar jämfört med traditionell magnetisk resonanstomografi (MRT) för att följa tillväxten av en experimentell intrakraniell tumör. Det mest uppenbara är den relativa kostnaden för de två instrumenten - djur MRI maskiner är betydligt dyrare och kräver normalt anlita en skicklig MRT tekniker. In vivo imaging, såsom vad som beskrivs här kan göras av slutanvändaren. Den bioluminescens data är kvantitativ, medan kvantifiering av MRT data är tidskrävande och något inexakt. Dessutom MRI-bilder visar ödem och inflammation i tillägg till tumörceller och det kan vara svårt att skilja tumören från behandlingseffekt. Av dessa skäl få korrekt volymetrisk mätning av växande tumör kan vara en utmaning. Bioluminescence kräver ATP, Därför endast levande tumörceller bidra till tumörstorlek data. Trots detta finns det några fördelar med MR om en maskin är tillgänglig. Cellerna behöver inte märkas med en självlysande markör som ska visualiseras genom MRI. Möjligheten att visualisera peri-tumoral ödem kan vara en fördel för vissa experimentella protokoll. En styrka i båda teknikerna är att med hjälp av en inte utesluter användningen av andra, så data kan erhållas på tillväxten av tumören samt förekomst av peri-tumoral ödem och inflammation från samma djur när båda teknikerna finns tillgängliga till forskaren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn eller tillhandahållande </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> GL261-luc2 Bioware Ultra </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> GL261-luc2 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10313039 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11811-023 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt kalvserum (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatsyntasgen saltlösning (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Möss </td><td> NCI-Frederick </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AKWA Tårar Smörjmedel Ophthalmic Salva </td><td> Akorn Inc </td><td> 17478-062-35 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaset (ketamin hydroklorid) </td><td> Wyeth </td><td> 11570775 </td><td></td></tr><tr><td> Sedazine (xylazinhydroklorid) </td><td> Wyeth </td><td> 10031894 </td><td></td></tr><tr><td> Small Animal Stereotaxic Instrument </td><td> Kopf Instrument </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump med SYS-Micro4 Controller </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> UMP3-1 </td><td> Om inte tillgängligt, är det möjligt att ingjuta manuellt </td></tr><tr><td> 10μl spruta med 26 gauge avfasade nål </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> SGE010RNS </td><td></td></tr><tr><td> Adison Tång </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 500.092 </td><td></td></tr><tr><td> Penfield DISSEKTOR </td><td> Codman </td><td> 65-1015 </td><td></td></tr><tr><td> 16g 1 ½ Precision Glide Needle </td><td> Beckton, Dickinson and Company (BD) </td><td> 305.198 </td><td></td></tr><tr><td> Kirurgiska Blade handtag </td><td> BD </td><td> 371.030 </td><td></td></tr><tr><td> Storlek 15 Blade </td><td> BD </td><td> 371.315 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 Vicryl Suture </td><td> Ethicon </td><td> VCP496G </td><td></td></tr><tr><td> Bone Wax </td><td> Medline </td><td> DYNJBW25 </td><td></td></tr><tr><td> Povidine-Jod svabbar minnen </td><td> Medline </td><td> MD93901 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferin kaliumsalt </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122.796 </td><td></td></tr><tr><td> Forane (isofluran) </td><td> Baxter </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> OPMI Pentero Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td> Varje kirurgisk mikroskop räcker </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS Spectrum med valfri anestesi-system </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intracranial implantation with subsequent 3d in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas

Musen gliom 261 (GL261) redovisas som en in vivo-modell system som rekapitulerar många av funktionerna i mänskliga glioblastoma multiforme (GBM). Den cellinje som ursprungligen orsakade av intrakraniella injektion av 3-metyl-cholantrene till en C57BL / 6 syngena musstam 1, och därför immunologiskt behöriga C57BL / 6 möss kan användas. Samtidigt som vi använder GL261 kan följande protokoll användas för implantation och övervakning av alla intrakraniella musen tumör modell. GL261 celler var konstruerad för att stabilt uttrycka eldfluga luciferas (GL261-luc). Vi skapade också ljusare GL261-luc2 cellinje av stabil transfektion av luc2 genen uttrycks från CMV promotor. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr möss (albino variant av C57BL / 6) från National Cancer Institute, Frederick, MD har använts för att hindra ljuset dämpning orsakad av svart hud och päls. Med hjälp av albino C57BL / 6 möss, in vivo imaging med IVIS Spectrum in vivo imåldrandet är möjligt från och med dagen för implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Den GL261-Luc och GL261-luc2 cellinjer visade samma uppträdande in vivo, eftersom föräldrarnas GL261 celler. Några av de delade histologiska funktioner som finns i människans sandblästrat stål och denna musmodell inkluderar: tumörnekros, pseudopalisades, kärlnybildning, invasion, hypercellularity och inflammation 1. Före implantationen djur bedövas av en intraperitoneal injektion av ketamin (50 mg / kg), xylazin (5 mg / kg) och buprenorfin (0,05 mg / kg), placeras i en stereotaktisk apparat och ett snitt gjordes med en skalpell över kraniella mittlinjen. En burrhole gjordes 0.1mm posteriort om bregma och 2.3mm till höger om mittlinjen. En nål sattes in till ett djup av 3mm och återkallade 0,4 mm till ett djup av 2,6 mm. Två ìl GL261-Luc eller GL261-luc2 celler (10 7 celler / ml) infunderas under loppet av 3 minuter. Den burrhole stängdesmed bonewax och snittet sys ihop. Efter stereotaktisk implantation den självlysande celler kan påvisas från och med dagen för implantation och tumören kan analyseras med hjälp av 3D-funktionen bilden rekonstruktion av IVIS Spectrum instrumentet. Djur får en subkutan injektion av 150 mikrogram luciferin / kg kroppsvikt 20 min före avbildning. Tumörbörda är kvantifieras med hjälp betyda tumör mareld över tiden. Tumör-bärande möss observerades dagligen för att bedöma sjuklighet och var avlivas när en eller flera av följande symtom förekommer: letargi, underlåtenhet att pendla, krökt kroppshållning, underlåtenhet att brudgummen, anorexi resulterar i&gt; 10% viktminskning. Tumörer var tydliga i samtliga djur på obduktion.

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas at JoVE.com

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intrakraniell implantation av GL261 celler i C57BL / 6 möss producerar maligna gliom att sammanfatta många av kännetecknen för mänskliga glioblastoma multiforme. Vi använde GL261 celler som stabilt uttrycker luciferas att tillåta oss att använda<em&gt; In vivo</em&gt; Avbildning följa tumörprogression. Operationen och 3D<em&gt; In vivo</em&gt; Bildbehandling demonstreras.

Intrakraniell Implantation med efterföljande 3D In Vivo Bioluminescent Imaging av murina Gliom

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Murina Bioluminescent Nedsatt tumör Modell

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantation av en Carotid Manschett för att utlösa Sear-stress åderförkalkning hos möss

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Stereotaktisk Intrakraniell Implantation och<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent avbildning av tumörxenografter i en musmodell system för glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

En mus modell av stentimplantation i halspulsådern för studier av restenos

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Högupplöst<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging teknik för att studera dynamiska svaret för intrakraniell Structures till tumörtillväxt och Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Murin Endoskopi för<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodal avbildning av Carcinogenesis och Bedömning av intestinala sårläkning och inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Murina Modell av lårbensartären Wire Skada med Implantation av en perivaskulär Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murinmodell av Fulminant-myokardit genom ljusarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...