Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Wij danken Dr Yih-Fan Chen voor hulp bij de axiale optisch pincet en om bij te dragen sommige van zijn stretching gegevens om dit manuscript. Dit werk werd gesponsord door NSF subsidie ​​PHY-0957293 en FOCUS subsidie ​​PHY-0114336.

1. Pincet Setup <ol><li> De bundel van een 1064 nm laser wordt gesplitst in twee orthogonaal gepolariseerde bundels. Een wordt gebruikt om het biomolecuul manipuleren terwijl de andere wordt gebruikt voor kalibratie doeleinden (zie Fig. 2). </li><li> De intensiteit van de bundel manipulatie wordt gecontroleerd door een acousto-optische deflector (AOD), terwijl de positie en de focus van elke bundel wordt onafhankelijk geregeld door bundelsturing spiegels en optische telescopen, respectievelijk. </li><li> De balken wor...

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Conventionele optische pincetten vertrouwen op analoge of computergestuurde feedback om een ​​constante kracht op refractiele object. Deze actieve feedback systemen moeilijk voeren onder omstandigheden waarbij plotselinge veranderingen in de verlenging van het monster optreden, bijvoorbeeld van de binding van een eiwit aan DNA of de snelle intensivering van een moleculaire motor langs een filament. Diverse passieve methoden voor de toepassing van constante krachten zijn recentelijk ontwikkeld. Een methode gebruikt o...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens / Equipment </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Nd: YVO4 laser </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Akoestisch-optische deflector </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop Doelstelling </td><td> Olympus </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Piezo fase </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> XYZ podium </td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Fotodetector </td><td> Electro-Optics Tech </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyreen kralen </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidine bedekt </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenine </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> Van schapen </td></tr><tr><td> Primers </td><td> MWG operon </td><td> Aangepaste oligo&#39;s </td><td> Een primer: biotine Andere: digoxigenine </td></tr><tr><td> PCR reagentia </td><td> New England Biolabs </td><td> TAQ polymerase, dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Andere chemicaliën voor buffer </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Aanvullende materialen A. Hydrodynamische Wrijvingscoëfficiëntt Voor het bepalen van de hydrodynamische wrijvingscoëfficiënt van de microsfeer de buurt van een oppervlak kan men gebruik maken van de volgende uitbreiding 5,10: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Vergelijking 1" /> waar de volgende afkorting hals ingevoerd: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Vergelijking 2" /> De wrijvingscoëfficiënt is gedefinieerd in termen van de viscositeit η en de straal van de microsfeer, met het centrum van de microsferen op een afstand boven het oppervlak η. De sommatie convergeert redelijk goed toen uitgebreid met een tiental termen. B. Invloed van axiale positie op Stijfheid Kalibratie De kalibratie van de trap stijfheid betreft een compromis tussen de nauwkeurigheid van de kalibratie neemt toe met toenemende afstand van het oppervlak en de feitelijke axiale positie waar de trap experimenteel gebruikt. In het algemeen wordt de trap gekalibreerd op ongeveer 800-1000 nm van het oppervlak, die hoger is dan de werkelijke experimentele conditie. C. Gewijzigd wormachtige Chain (WLC) Model De kracht extensie curves kunnen worden geschikt om een ​​aangepaste WLC model die goed is voor het volume uitsluiting effecten op nul optische kracht als volgt: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Vergelijking 3" /> waarbij F opt de optische kracht, x o een parameter fit voor de nul kracht extensie x opt de uitbreiding onder dwang, l de lengte van de contour DNA en l * p is een tweede parameter fit voor een &quot;effectieve &quot;persistentielengte. WLC F wordt gegeven door de gebruikelijke WLC model 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Vergelijking 4" /> waarbij ε de relatieve DNA extensie.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Single-molecule technieken voor stretching DNA van contour lengte minder dan een kilobase zijn beladen met experimentele moeilijkheden. Veel interessante biologische gebeurtenissen zoals histon binding en eiwit gemedieerde DNA looping van 1,2, later op deze lengteschaal. In de afgelopen jaren zijn de mechanische eigenschappen van DNA aangetoond een belangrijke rol te spelen in fundamentele cellulaire processen zoals de verpakking van DNA in nucleosomen en compact chromatinevezels 3,4. Duidelijk is dan belangrijk om de mechanische eigenschappen van korte stukjes DNA. In dit artikel geven we een praktische gids voor een single-molecule optische pincet techniek die we hebben ontwikkeld om het mechanisch gedrag van DNA met contour lengtes zo kort als een paar honderd baseparen te bestuderen. De belangrijkste hindernis in rekken korte segmenten van DNA is dat de conventionele optische pincetten zijn over het algemeen ontworpen om kracht uit te oefenen in een direction lateraal van het podium 5,6, (zie Fig. 1). In deze geometrie de hoek tussen de hiel en het dekglaasje, waaraan het DNA wordt vastgemaakt, wordt erg hoog voor submicron lengte DNA. De axiale positie moet nu rekening worden gehouden, dat kan een uitdaging zijn, en aangezien de uitbreiding sleept de microsfeer dichter bij de dekglaasje, sterische effecten worden versterkt. Bovendien als gevolg van de asymmetrie van de microsferen zal zijdelingse verlengingen genereren verschillende niveaus koppel door rotatie van de microsfeer in de optische val aangezien de richting van de reactiekracht veranderingen tijdens de extensie. Alternatieve methoden voor het strekken submicron DNA oplopen tegen hun eigen unieke hindernissen. Zo is een dual-beam optische val beperkt tot rekken DNA van ongeveer een golflengte, waarna interferentie tussen de twee trappen en van lichtverstrooiing tussen de microsferen beginnen een groot probleem vormen. Vervangen van een trapsmet een micropipet hoogstwaarschijnlijk lijden soortgelijke uitdagingen. Men zou rechtstreeks het axiale potentieel om de DNA rekken, een actieve feedback regeling nodig zijn om een ​​constante kracht en de bandbreedte hiervan zeer beperkt, met name bij lage uitgeoefend. We omzeilen deze fundamentele problemen door direct te trekken van het DNA uit de buurt van het dekglaasje met behulp van een constante kracht axiale optisch pincet 7,8. Dit wordt bereikt door het vangen van de kraal in een lineair gebied van de optische mogelijkheden, waarbij de optische kracht constante waarvan de sterkte kan worden geregeld door het laservermogen. Vangen binnen het lineaire gebied vormt ook alle optische kracht-klem op de DNA dat zich bijna 350 nm in axiale richting. We gelijktijdig compenseren voor thermische en mechanische drift van fijn instellen van de positie van het werkgebied zodat een verwijzing microsfeer vast aan het dekglaasje blijft op dezelfde positie en focus, eenllowing voor een vrijwel onbeperkte observatieperiode.

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Wordt het gebruik van een constante kracht axiaal optische pincetten om de mechanische eigenschappen van korte DNA moleculen te verkennen. Door stretching DNA axiaal, minimaliseren we sterische hindernissen en artefacten die in conventionele laterale manipulatie, waardoor we DNA-moleculen te bestuderen zo kort ~ 100 nm.

Stretching korte sequenties van DNA met Constant Force Axiale optisch pincet

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Magnetische pincet voor het meten van Twist en Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Dubbele Emulsion Generation Met een Polydimethylsiloxaan (PDMS) Co-axiale Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...