Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
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Nous remercions le Dr Chen Yih-Fan de l&#39;aide avec les pinces optiques axiales et de contribuer certaines de ses données d&#39;étirement pour ce manuscrit. Ce travail a été financé par la NSF subvention PHY-0957293 et ​​FOCUS subvention PHY-0114336.

1. Pince à épiler Setup <ol><li> Le faisceau d&#39;un laser à 1064 nm est séparé en deux faisceaux polarisés orthogonalement. On est habitué à manipuler la biomolécule tandis que l&#39;autre est utilisée à des fins d&#39;étalonnage (voir Fig. 2). </li><li> L&#39;intensité du faisceau est commandée par la manipulation d&#39;un déflecteur acousto-optique (OD), tandis que la position et l&#39;orientation de chaque faisceau est commandé indépendamment par des miroirs d&#39;orientation du faisceau et de t?...

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	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. 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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Pinces optiques classiques invoquer supporte rétroaction analogique ou commandé par ordinateur pour appliquer une force constante sur un objet réfringent. Ces systèmes de rétroaction actifs ont du mal à effectuer dans des conditions où des changements brusques de l&#39;extension de l&#39;échantillon se produire, par exemple, à partir de la liaison d&#39;une protéine à l&#39;ADN ou l&#39;intensification rapide d&#39;un moteur moléculaire le long d&#39;un filament. Diverses méthodes passives d&#39;application...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactif / équipement </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Laser Nd: YVO4 </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acousto-optique déflecteur </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Objectif Microscope </td><td> Olympe </td><td> Planapo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Stade Piezo </td><td> Mad Labs Ville </td><td> Nano-LP100 </td><td> Platine XYZ </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> PixeLINK </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodétecteur </td><td> Électro-Optique Technologie </td><td> HE-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Perles de polystyrène </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800 nm, la streptavidine recouvert </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> Du mouton </td></tr><tr><td> Amorces </td><td> MWG opéron </td><td> Oligos personnalisés </td><td> Une amorce: la biotine Autres: digoxigénine </td></tr><tr><td> Réactifs de PCR </td><td> Nouvelle-Angleterre Biolabs </td><td> Taq polymérase, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Lamelle </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> D&#39;autres produits chimiques pour tampon </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Documents complémentaires Coefficient de frottement hydrodynamique A. Pour la détermination du coefficient de frottement hydrodynamique de la microsphère près de la surface, on peut utiliser les 5,10 extension suivants: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> où le raccourci suivant hcomme cela a été mis en place: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Équation 2" /> Le coefficient de frottement est définie en termes de la viscosité du fluide η et le rayon de la microsphère, la microsphère avec le centre, situé η une distance au-dessus de la surface. La somme converge assez bien quand il est étendu à une dizaine de termes. B. Influence de la position axiale sur l&#39;étalonnage Raideur L&#39;étalonnage de la rigidité piège implique un compromis entre la précision de l&#39;étalonnage, ce qui augmente avec la distance à partir de la surface, et la position axiale réelle lorsque le piège est utilisé expérimentalement. En général, le piège est calibré à environ 800-1000 nm de la surface, qui est supérieure à l&#39;état réel expérimentale. C. Mise à jour Worm-Like Chain (WLC) Modèle Les courbes de vulgarisation de force peut être adapté à une modification WLC modèle qui tient compte des effets d&#39;exclusion de volume à la force optique zéro comme suit: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="L&#39;équation 3" /> où F est la force opt optique, x o est un paramètre propre à l&#39;extension de la force de zéro, x opt est l&#39;extension sous effort, l est la longueur du contour de l&#39;ADN, et l * p est un paramètre de forme pour une seconde efficace &quot; longueur de persistance &quot;. wlc F est donnée par le modèle habituel WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="L&#39;équation 4" /> où ε est l&#39;extension de l&#39;ADN par rapport.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Une seule molécule d&#39;ADN techniques d&#39;étirement des longueurs de contour moins d&#39;un kilobases sont marquées par des difficultés expérimentales. Cependant, de nombreux événements intéressants biologiques tels que fixation sur les histones et les protéines médiée par boucle d&#39;ADN 1,2, se produisent sur ​​cette échelle de longueur. Ces dernières années, les propriétés mécaniques de l&#39;ADN ont été montré à jouer un rôle important dans les processus cellulaires fondamentaux comme l&#39;empaquetage de l&#39;ADN dans les nucléosomes compacts et des fibres de chromatine 3,4. De toute évidence, il est alors important de comprendre les propriétés mécaniques de courts tronçons de l&#39;ADN. Dans cet article, nous proposons un guide pratique pour une technique simple molécule optique tweezing que nous avons développé pour étudier le comportement mécanique de l&#39;ADN avec des longueurs de contour aussi courts que quelques centaines de paires de bases. Le principal obstacle à étirer courts segments d&#39;ADN, c&#39;est que les pinces optiques classiques sont généralement conçus pour appliquer une force dans une direction latéral à l&#39;étape 5,6, (voir Fig. 1). Dans cette géométrie, l&#39;angle entre le bourrelet et la lamelle couvre-objet, dans laquelle l&#39;ADN est attaché, est très raide pour l&#39;ADN de longueur inférieure au micron. La position axiale doivent maintenant être pris en compte, ce qui peut être un défi, et, depuis l&#39;extension entraîne la microsphère près de la lamelle, effets stériques sont améliorées. En outre, en raison de l&#39;asymétrie des microsphères, des extensions latérales génère différents niveaux de couple due à la rotation de la microsphère dans le piège optique depuis la direction de la force de réaction pendant les changements de l&#39;extension. D&#39;autres méthodes de l&#39;ADN submicronique étirement se heurtent à leurs propres obstacles uniques. Par exemple, un piège à double faisceau optique est limitée à l&#39;étirement d&#39;ADN d&#39;environ une longueur d&#39;onde, au cours de laquelle les effets d&#39;interférence de points entre les deux pièges et de diffusion de la lumière entre les microsphères commence à poser un problème important. Remplacer l&#39;un des piègesavec une micropipette serait très probablement souffrir de problèmes similaires. Si l&#39;on peut utiliser directement le potentiel axiale d&#39;étirer l&#39;ADN, un schéma de rétroaction active serait nécessaire pour appliquer une force constante et la bande passante ce sera très limitée, en particulier à de faibles forces. Nous contourner ces problèmes fondamentaux en tirant directement l&#39;ADN loin de la lamelle à l&#39;aide d&#39;une force axiale constante de pinces optiques 7,8. Ce résultat est obtenu en piégeant le bourrelet dans une zone linéaire du potentiel optique, lorsque la force est constante optique-dont la force peut être ajustée par réglage de la puissance du laser. Piégeage à l&#39;intérieur de la région linéaire sert aussi de tout optique de force de serrage sur l&#39;ADN qui s&#39;étend depuis près de 350 nm dans la direction axiale. Nous simultanément compenser la dérive thermique et mécanique par le réglage fin de la position de la platine de telle sorte que d&#39;une microsphère de référence collée sur la lamelle couvre-objet reste à la même position et orientation, unellowing pour une période d&#39;observation pratiquement illimitées.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Nous illustrons l&#39;utilisation d&#39;une constante de force axiale pinces optiques pour étudier les propriétés mécaniques des molécules d&#39;ADN courts. En étirant l&#39;ADN axialement, nous minimisons empêchements stériques et des artefacts liés à la manipulation latérale conventionnelle, ce qui nous permet d&#39;étudier les molécules d&#39;ADN plus court ~ 100 nm.

S&#39;étendant de courtes séquences d&#39;ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Recherche

Bio-ingénierie

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Constant procédé d&#39;extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

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We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion génération utilisant un flux focus périphérique (PDMS) Co-axial

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...