Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר Yih-Fan חן לעזרה עם פינצטה האופטית הצירית ותורם לחלק מהנתונים של מתיחתו לכתב היד הזה. עבודה זו מומנה על ידי מענק NSF PHY-0957293 ולהתמקד מענק PHY-0114336.

1. פינצטה התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלומת ליזר מננומטר 1064 מחולקת לשתי אלומות orthogonally מקוטבות. אחד משמש כדי לתפעל את biomolecule ואילו השני משמש למטרות כיול (ראה איור. 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת קרן המניפולציה נשלטת על ידי הטיה acousto אופטי...

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

פינצטה אופטית קונבנציונלית להסתמך על משוב או אנלוגי או מבוקר מחשב להפעיל כוח קבוע על אובייקט refractile. מערכות משוב פעילים אלו יש קושי בביצוע בתנאים שבו שינויים פתאומיים בהארכה את הדגימה מתרחשים, למשל, מההתקשרות של חלבון ל-DNA או הקפיצה המהירה של מנוע מולקולרי לאורך חוט. ש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגים </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Nd: ליזר YVO4 </td><td> ספקטרה פיסיקה </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acousto אופטי מטה הטיה </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> מטרת מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> PlanApo </td><td> 60x, 1.4 NA </td></tr><tr><td> שלב Piezo </td><td> מעבדות עיר מטורפות </td><td> Nano-LP100 </td><td> שלב XYZ </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodetector </td><td> אלקטרו אופטיקה טק </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי פוליסטירן </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidin מצופה </td></tr><tr><td> אנטי digoxigenin </td><td> רוש </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> מכבשים </td></tr><tr><td> Primers </td><td> MWG אופרון </td><td> oligos המותאם אישית </td><td> פריימר אחד: ביוטין אחר: digoxigenin </td></tr><tr><td> ריאגנטים PCR </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> פולימראז תקי, dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כימיקלים אחרים עבור בלם </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> חומרים משלימים מקדם חיכוך הידרודינמית א לקביעת מקדם החיכוך הידרודינמית של microsphere ליד משטח אחד ישתמש ב5,10 ההרחבה הבא: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> שם קיצור השעות הבאותכפי שהציג: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> מקדם החיכוך מוגדר במונחים של את צמיגות נוזל η והרדיוס של microsphere, עם המרכז של microsphere ממוקם מרחק η מעל פני השטח. הסיכום מתכנס סביר כאשר התרחבו לכ 10 מונחים. השפעה על מצב ב &#39;צירי על כיול נוקשות הכיול של קשיחות המלכודת כרוכה איזון בין דיוק הכיול, אשר מגביר במרחק גדל והולך משטח, והעמדה הצירית האמיתית שבו המלכודת משמשת בניסוי. באופן כללי, המלכודת מכוילת בסביבות 800-1000 ננומטר מהמשטח, שהוא גבוה יותר מתנאי הניסוי בפועל. ג השתנה שרשרת דגם דמוי תולעת (WLC) העקומות המאריכות הכח ניתן להתאים לעדכון WLC מ &#39;אודל, שמסביר את תופעות הדרת נפח בכוח אופטי אפס כדלקמן: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="משוואה 3" /> כאשר F הוא כוח opt האופטי, x o היא פרמטר ראוי להארכת התוקף אפס, x opt הוא ההארכה בכוח, אני הוא אורך קווי המתאר של ה-DNA, ואני * p הוא פרמטר שני לכושר &quot;יעיל &quot;אורך התמדה. F WLC ניתן על ידי המודל הרגיל WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="משוואה 4" /> בי ε היא הסיומת-DNA היחסית.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

טכניקות מולקולה בודדה למתיחת DNA של אורכי גובה פחות מkilobase הן כרוכות בקשיים ניסיוניים. עם זאת, מספר רבים של אירועים ביולוגיים מעניינים כגון מחייב היסטון וחלבון בתיווך לולאות של DNA 1,2, מתרחשים בקנה מידת אורך זו. בשנים האחרונות, את התכונות המכאניות של ה-DNA הוכחו לשחק תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים בסיסיים כמו האריזה של ה-DNA לתוך nucleosomes הקומפקטי וסיבי הכרומטין 3,4. ברור, אז זה חשוב להבין את התכונות המכאניות של מותחים קצרה של ה-DNA. במאמר זה, אנו מספקים מדריך מעשי לטכניקת מריטות חוזרת ונשנית מולקולה בודדה אופטית שפתחנו כדי ללמוד את ההתנהגות המכאנית של ה-DNA באורכי גובה זמן הקצר של כמה מאה basepairs. המשוכה העיקרית במתיחת קטעים קצרים של DNA היא שפינצטה אופטית קונבנציונלית נועדה בדרך כלל להפעלת כוח בdirection לרוחב לשלב 5,6, (ראה איור. 1). בגיאומטריה זה, הזווית בין החרוז וcoverslip, כדי שהדנ&quot;א הוא קשור, הופכת תלולה מאוד לדנ&quot;א אורך submicron. העמדה הצירית עכשיו יש בחשבון, שיכול להיות אתגר, ומאז ההארכה גוררת microsphere קרוב יותר לcoverslip, אפקטים סטריים משופרים. יתר על כן, כתוצאה מהסימטריה של microspheres, רחבות לרוחב תפקנה רמות שונות של מומנט עקב סיבוב של microsphere בתוך המלכודת האופטית מאז הכיוון של שינויי הכח תגובתי במהלך ההארכה. שיטות חלופיות לדנ&quot;א submicron מתיחה נתקלות מכשולים הייחודיים משלהם. לדוגמה, מלכודת קורה כפול אופטית מוגבלת למתיחות סביב ה-DNA של גל, שבו השפעות התערבות נקודות בין שתי מלכודות ומפיזור האור בין microspheres מתחילות להוות בעיה משמעותית. החלפה אחת מהמלכודותעם micropipette היית כנראה סובל מאתגרים דומים. בעוד אחד יכול להשתמש ישירות את הפוטנציאל הצירי למתוח את ה-DNA, סכימת משוב פעילה, תהיה צורך להפעיל כוח קבוע ורוחב הפס של זה יהיה מוגבל למדי, במיוחד בכוחות נמוכים. אנו לעקוף בעיות יסוד אלה על ידי משייכת ישירות את ה-DNA מcoverslip באמצעות כוח קבוע הצירית האופטית פינצטה 7,8. זו מושגת על ידי לכידת החרוז באזור ינארית של הפוטנציאל האופטי, שבו הכח האופטי הוא הכח קבוע, אשר יכול להיות מכוון על ידי התאמת כוח הליזר. השמנה באזור יניארי משמשת גם ככוח-מהדק כל אופטי בדנ&quot;א המשתרע על כמעט 350 ננומטר בכיוון הצירי. אנחנו במקביל לפצות על סחיפה תרמית ומכאנית על ידי התאמת העמדה של השלב דק, כך שההתייחסות microsphere הדבוק לcoverslip נשאר באותה העמדה ומיקוד,llowing לתקופת תצפית בלתי מוגבלת כמעט.

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

אנו מדגימים את השימוש בפינצטה אופטית צירית קבועה כוח כדי לחקור את התכונות המכאניות של מולקולות דנ&quot;א קצרות. על ידי מתיחת DNA axially, אנחנו למזער מכשולים וממצאים שמקורם במניפולצית רוחב קונבנציונלית סטריים, ומאפשרים לנו לחקור מולקולות דנ&quot;א קצרה כמו ~ 100 ננומטר.

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...