Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
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हम axial ऑप्टिकल चिमटी के साथ मदद के लिए और अपने खींच डेटा की इस पांडुलिपि के लिए कुछ योगदान देने के लिए डा. Yih फैन चेन धन्यवाद. यह काम NSF बनावट 0957293 अनुदान और ध्यान बनावट-0114336 अनुदान द्वारा प्रायोजित किया गया था.

1. चिमटी सेटअप <ol><li> एक 1064 एनएम लेजर बीम orthogonally दो polarized मुस्कराते हुए में विभाजित है. एक जबकि अन्य अंशांकन प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्र देखें 2.) Biomolecule में हेरफेर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. </li><li> ...

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	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

पारंपरिक ऑप्टिकल चिमटी एक refractile वस्तु पर एक निरंतर बल लागू करने के लिए या तो अनुरूप या कंप्यूटर नियंत्रित प्रतिक्रिया पर भरोसा करते हैं. इन सक्रिय प्रतिक्रिया प्रणालियों शर्तों जहां नमूना के विस्तार म...

<table border="1"><tbody><tr><th> / अभिकर्मक और उपकरण </th><th> कंपनी </th><th> कैटलॉग संख्या </th><th> टिप्पणियां </th></tr><tr><td> एन डी: YVO4 लेजर </td><td> स्पेक्ट्रा भौतिकी </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acousto ऑप्टिक झुकानेवाला </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> माइक्रोस्कोप उद्देश्य </td><td> ओलिंप </td><td> PlanApo </td><td> 60x, 1.4 NA </td></tr><tr><td> Piezo मंच </td><td> पागल सिटी लैब्स </td><td> नैनो LP100 </td><td> XYZ मंच </td></tr><tr><td> सीसीडी कैमरा </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodetector </td><td> इलेक्ट्रो - प्रकाशिकी टेक </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyrene मोती </td><td> Spherotech </td><td> एसवीपी-08-10 </td><td> 800nm, streptavidin लेपित </td></tr><tr><td> विरोधी digoxigenin </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> भेड़ों से </td></tr><tr><td> प्राइमर्स </td><td> MWG operon </td><td> कस्टम oligos </td><td> एक प्राइमर: बायोटिन अन्य: digoxigenin </td></tr><tr><td> पीसीआर अभिकर्मकों </td><td> न्यू इंग्लैंड Biolabs </td><td> Taq पोलीमरेज़, dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td></td><td></td></tr><tr><td> के लिए अन्य रसायनों बफर </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> पूरक सामग्री ए Hydrodynamic घर्षण गुणांक Microsphere की सतह के पास hydrodynamic घर्षण गुणांक का निर्धारण करने के लिए एक निम्न विस्तार 5,10 का उपयोग कर सकते हैं: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="1 समीकरण" /> जहां निम्नलिखित आशुलिपि जके रूप में पेश किया गया है: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="2 समीकरण" /> microsphere सतह के ऊपर एक दूरी η स्थित केंद्र के साथ घर्षण गुणांक द्रव चिपचिपापन η और microsphere की त्रिज्या के रूप में परिभाषित किया गया है. समेशन काफी अच्छी तरह से converges जब दस के बारे में शब्दों के लिए विस्तारित. बी Axial स्थिति की कठोरता अंशांकन पर प्रभाव जाल कठोरता के अंशांकन अंशांकन की सटीकता, जो सतह से दूरी बढ़ाने के साथ बढ़ जाती है और वास्तविक axial स्थिति जहां जाल प्रयोगात्मक प्रयोग किया जाता है के बीच एक tradeoff शामिल है. सामान्य में, जाल सतह है, जो वास्तविक प्रयोगात्मक हालत की तुलना में अधिक है से 800-1000 एनएम पर calibrated है. सी. संशोधित कीड़ा की तरह चेन मॉडल (WLC) बल विस्तार घटता एक बार संशोधित WLC मीटर करने के लिए फिट किया जा सकता हैODEL कि मात्रा के रूप में शून्य ऑप्टिकल शक्ति में बहिष्कार प्रभाव के लिए खातों: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="3 समीकरण" /> एक्स चुनते हैं, एक्स ओ, जहां एफ ऑप्ट ऑप्टिकल शक्ति शून्य बल विस्तार के लिए एक फिट पैरामीटर बल के तहत विस्तार है, मैं डीएनए की लंबाई समोच्च है, और * पी ​​एल एक &quot;प्रभावी करने के लिए एक दूसरे फिट पैरामीटर है &quot;हठ लंबाई एफ WLC सामान्य WLC 11 मॉडल के द्वारा दिया जाता है <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="4 समीकरण" /> जहां ε रिश्तेदार डीएनए विस्तार है.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

हम एक निरंतर बल axial ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करने के लिए कम डीएनए अणु के यांत्रिक गुणों का पता लगाने का वर्णन. डीएनए axially खींच, हम steric hindrances और पारंपरिक पार्श्व हेरफेर में उत्पन्न होने वाली कलाकृतियों को कम करने के लिए, हमें ~ 100 एनएम के रूप में कम के रूप में डीएनए अणु का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.

निरंतर बल Axial ऑप्टिकल चिमटी के साथ डीएनए की कम दृश्यों टूटती

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

पुनः संयोजक डीएनए और प्रोटीन परिसरों परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग का विज़ुअलाइज़ेशन

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

मल्टिप्लेक्स एकल अणु सेना proteolysis चुंबकीय चिमटी का उपयोग माप

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

लगातार दबाव नियंत्रित नैनो आकार लिपिड vesicles की तैयारी के लिए बाहर निकालना विधि

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Endothelial glycocalyx मैकेनिकल गुण बढ़ाता

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM आधारित एकल अणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ Cellulosome के रिसेप्टर ligand सिस्टम की जांच कर

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

मात्रात्मक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी: सेलुलर की biophysical के मापन के लिए एक मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ सुविधाएँ

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

एक PDMS झिल्ली पर micropatterned प्रकोष्ठों टूटती

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

ट्विस्ट और टोक़ के मापन के लिए चुंबकीय चिमटी

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

ऑप्टिकल चिमटी से एकल आरएनए अणुओं के Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

एक polydimethylsiloxane (PDMS) सह-अक्षीय प्रवाह फोकस डिवाइस का उपयोग डबल पायस पीढ़ी

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...