Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
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Ringraziamo il Dott. Yih-Fan Chen per un aiuto con le pinzette ottiche assiali e per contributo di alcuni dei suoi dati che si estende a questo manoscritto. Questo lavoro è stato sponsorizzato da NSF concedere PHY-0957293 e FOCUS concessione PHY-0114336.

1. Pinzette di installazione <ol><li> Il fascio di un laser 1064 nm è divisa in due fasci polarizzati ortogonalmente. Uno è usato per manipolare la biomolecola mentre l&#39;altro viene usato per scopi di taratura (vedi fig. 2). </li><li> L&#39;intensità del fascio di manipolazione è controllato da un acustoottico deflettore (AOD), mentre la posizione e la messa a fuoco di ogni fascio viene controllata indipendentemente da specchi di orientamento del fascio e telescopi ottici, rispettivamente. </li><li> Le travi ve...

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	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. 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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Pinzette ottiche convenzionali invocare o retroazione analogica o controllato dal computer per applicare una forza costante su un oggetto rifrangenti. Questi sistemi di feedback attivi hanno difficoltà a svolgere in condizioni in cui sbalzi l&#39;estensione del campione si verificano, per esempio, dal legame di una proteina di DNA o il passo rapido di un motore molecolare lungo un filamento. Vari metodi passivi per applicare forze costanti sono recentemente sviluppate. Un tale metodo, utilizzato per risolvere l&#39;int...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Laser Nd: YVO4 </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acustoottico deflettore </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> Planapo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Piezo fase </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> XYZ fase </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> PIXELINK </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Rilevatori </td><td> Electro-Optics Tech </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Polistirolo Perline </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidina rivestito </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> Dalla pecora </td></tr><tr><td> Primers </td><td> MWG operone </td><td> Oligo personalizzati </td><td> Una mano di fondo: biotina Altro: digossigenina </td></tr><tr><td> Reagenti PCR </td><td> Nuova Inghilterra Biolabs </td><td> TAQ polimerasi, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Vetrino </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Altri prodotti chimici per bufferizzare </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Materiali complementari A. Coefficiente di attrito idrodinamico Per la determinazione del coefficiente di attrito idrodinamico della microsfera prossimità di una superficie si possono usare le seguenti 5,10 espansione: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> dove la h stenografia seguentecome state introdotte: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> Il coefficiente di attrito è definito in termini di viscosità η del fluido e il raggio della microsfera, con il centro di microsfere di una distanza η situato sopra la superficie. La sommatoria converge abbastanza bene quando ampliato per una decina di termini. Influenza B. della posizione assiale sulla stazzatura Rigidità La taratura della rigidità trappola comporta un compromesso tra la precisione della calibrazione, che aumenta con l&#39;aumentare della distanza dalla superficie, e la posizione assiale effettivo in cui viene utilizzata la trappola sperimentalmente. In generale, la trappola viene tarato a circa 800-1000 nm dalla superficie, che è superiore alla effettiva condizione sperimentale. C. modificato Worm-Like a catena (WLC) Modello Le curve forza di estensione può essere adatto ad un WLC modificato modello che tiene conto degli effetti di volume di esclusione a zero forza ottica nel modo seguente: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Equazione 3" /> dove F è la forza opt ottico, X o è un parametro di misura per la forza di estensione zero, x opt è l&#39;estensione in vigore, L è la lunghezza del profilo del DNA, e L * p è un parametro di misura secondo un &quot;efficace &quot;lunghezza di persistenza. F wlc è dato dal consueto modello WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Equazione 4" /> dove ε è l&#39;estensione di DNA relativo.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Singola molecola tecniche di allungamento del DNA di lunghezze di profilo meno di un kilobasi sono irto di difficoltà sperimentali. Tuttavia, molti interessanti eventi biologici come legame istoni e proteine ​​mediata da loop di DNA 1,2, si verificano su questa scala di lunghezza. In anni recenti, le proprietà meccaniche del DNA hanno dimostrato di giocare un ruolo significativo nel fondamentali processi cellulari come il confezionamento di DNA in nucleosomi compatti e fibre cromatina 3,4. Chiaramente, è quindi importante capire le proprietà meccaniche dei brevi tratti di DNA. In questo lavoro forniamo una guida pratica di una tecnica singola molecola tweezing ottica che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento meccanico del DNA con lunghezza di contorno più corti a poche centinaia di paia di basi. L&#39;ostacolo principale che si estende in brevi segmenti di DNA è che convenzionali pinzette ottiche sono generalmente progettati per applicare la forza in un direction laterale alla fase 5,6, (vedi fig. 1). In questa geometria, l&#39;angolo tra il tallone ed il coprioggetto, a cui il DNA è legato, diventa molto ripida per DNA lunghezza submicron. La posizione assiale deve ora essere rappresentato, che può essere una sfida, e, in quanto l&#39;estensione trascina microsfera più vicino al vetrino, effetti sterici sono migliorate. Inoltre, a causa della asimmetria delle microsfere, prolungamenti laterali genererà diversi livelli di coppia dovuta alla rotazione della microsfera all&#39;interno della trappola ottica poiché la direzione dei cambiamenti forza di reazione durante l&#39;estensione. Metodi alternativi per il DNA submicron estende correre contro i propri ostacoli unici. Per esempio, una trappola doppio raggio ottico è limitata allo stiramento DNA di circa una lunghezza d&#39;onda, in cui gli effetti di interferenza di punti tra le due trappole e dalla dispersione della luce tra le microsfere iniziano a rappresentare un problema significativo. Sostituzione di una delle trappolecon una micropipetta molto probabilmente soffre di problemi analoghi. Sebbene si possa utilizzare direttamente il potenziale assiale per allungare il DNA, un regime di retroazione attiva sarebbe necessaria per applicare una forza costante e la larghezza di banda di questo è piuttosto limitata, soprattutto a basse forze. Abbiamo aggirare questi problemi di fondo direttamente tirando il DNA dal vetrino utilizzando una forza assiale costante pinzette ottiche 7,8. Ciò è ottenuto intrappolando il tallone in una regione lineare del potenziale ottico, in cui la forza ottica è costante la forza che può essere regolato regolando la potenza del laser. Intrappolando all&#39;interno della regione lineare serve anche come un tutto ottico forza-clamp sul DNA che si estende per circa 350 nm in direzione assiale. Abbiamo contemporaneamente compensare la deriva termica e meccanica finemente regolando la posizione della fase in modo che una microsfera riferimento attaccata al vetrino rimane nella stessa posizione e fuoco, unllowing per un periodo di osservazione praticamente illimitata.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Illustriamo l&#39;uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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