Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
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我々は、軸方向の光ピンセットのヘルプについては、この原稿に彼のストレッチングデータの一部を寄付するための博士儀·ファンチェンに感謝します。この作品は、NSFの助成金、PHY-0957293とフォーカス助成PHY-0114336によって後援されています。

1。ピンセットセットアップ<ol><li> 1064 nmのレーザーからのビームは、2つの直交偏光ビームに分割される。一つは、他のが（図2参照）、キャリブレーション用に使用されている間生体分子を操作するために使用されています。 </li><li>各ビームの位置と焦点がそれぞれ独立して、ビーム·ステアリングミラーや光学望遠鏡によって制御されながら操作ビームの強度は、音響光学偏向器（AOD）に...

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. 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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

従来の光ピンセットは、屈折物体に一定の力を適用するために、アナログまたはコンピューター制御のフィードバックに依存しています。これらのアクティブ·フィードバック·システムは、タンパク質の結合に由来するDNAまたはフィラメントに沿って分子モーターの急速なステッピングには、例えば、試料の延長の急激な変化が発生した条件の下で行うことが困難である。一定の力を加える...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/機器</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>注釈</th></tr><tr><td>のNd：YVO4レーザー</td><td>スペクトラフィジックス</td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td>音響光学の そらせ板</td><td> IntraAction </td><td> DTDベース274HA6 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡対物</td><td>オリンポス</td><td> PlanApo </td><td> 60X、NAは1.4 </td></tr><tr><td>ピエゾステージ</td><td>マッド·シティ·ラボ</td><td>ナノLP100 </td><td> XYZステージ</td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td>光検出器</td><td>電気光学 テク</td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンビーズ</td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td>波長800nm​​、ストレプトアビジン コー​​ティングされた</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン</td><td>ロッシュ</TD&gt; <td> 11333089001 </td><td>羊から</td></tr><tr><td>プライマー</td><td> MWGオペロン</td><td>カスタムオリゴ</td><td>一方のプライマー：ビオチン その他：ジゴキシゲニン</td></tr><tr><td> PCR試薬</td><td>ニューイングランド バイオラボズ</td><td> Taqポリメラーゼ、 のdNTP </td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のための他の化学物質 バッファ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>補足資料 A.流体摩擦係数表面近傍の微小球の流体力学的摩擦係数を決定するための1は、以下の拡張5,10を使用することができます： <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="式（1）" />どこで次の速記時間として導入されて： <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="式（2）" />摩擦係数は表面上の距離ηを位置の微小球の中心で、流体の粘度ηと微小球の半径で定義されます。 10約条項に展開したとき和はそれなりに収束する。 剛性校正上の軸方向位置のBの影響トラップ剛性のキャリブレーションは、表面からの距離が増加すると共に増加するキャリブレーションの精度、およびトラップを実験的に使用される実際の軸の位置との間でトレードオフが必要となります。一般的には、トラップが実際の実験条件よりも高い表面、800から1000 nm付近で校正されています。 C.は、ワームのようなチェーン（WLC）のモデルを変更力拡張曲線が変更されたWLC mに合うことができるodelその次のようにゼロ光の力で体積排除効果を考慮： <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="式（3）" /> F optは光学力であり、x oはゼロ力拡張のためのフィットパラメータであり、x optは力の下で拡張したもので、lは DNAの輪郭長であり、l * p &quot; は効果的なのための第2嵌合パラメータである&quot;持続長、F WLCは通常のWLCモデル11で与えられます。 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="式（4）" /> ここで、ε相対DNAの拡張子は。

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

小さいキロより輪郭の長さのDNAを延伸する単一分子技術は実験的困難をはらんでいます。しかし、このようなヒストン結合し、DNAの1,2タンパク質媒介ルーピングなど、多くの興味深い生物学的事象は、この長さスケールで発生します。近年では、DNAの機械的特性は、コンパクトなヌクレオソームとクロマチン繊維3,4へのDNAのパッケージングのような基本的な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、それは、DNAの短いストレッチの機械的性質を理解することが次に重要です。本稿では、我々は数百塩基対程度の短い輪郭長を持つDNAの機械的挙動を研究するために開発した単一分子光tweezing技術に実用的なガイドを提供します。 DNAの短いセグメントをストレッチングの主なハードルは、従来の光ピンセットは、一般のdirectioに力を適用するために設計されていることであるnは5,6ステージに横方向（図1参照）。この幾何学では、DNAが繋がれているためビーズとカバーガラス、、の間の角度は、サブミクロンの長さのDNAのための非常に急峻になる。軸方向の位置は、現在拡張子がカバースリップに近い微小球をドラッグしているので、立体効果が強化され、挑戦することができ、これを占めており、されなければならない。さらに、微小球の非対称性の結果として、横方向の拡張は、拡張時の反力の変化の方向が光学トラップ内の微小球の回転によるトルクのさまざまなレベルを生成します。 ストレッチサブミクロンDNAのための代替方法は、独自のユニークなハードルにぶつかる。例えば、デュアルビーム光学トラップが2つのトラップの間に微小球の間の光の散乱点からの干渉の影響が重大な問題を提起するために開始する波長、周りのDNAを引き伸ばしに制限されています。トラップの1つを交換マイクロピペットで最も可能性が高い同様の課題に苦しむだろう。一つは直接DNAを伸ばすために軸方向のポテンシャルを使うこともできますが、アクティブ·フィードバック方式は一定の力を適用し、この帯域幅は、特に低力で、かなり限定されますが必要でしょう。 我々は、直接一定の力軸方向の光ピンセット7,8を使用してカバーグラスから離したDNAを引いて、これらの根本的な問題を回避する。これは、光力がある光学ポテンシャル、定レーザーパワーを調節することによって調整することができるの強さの線形領域でビーズを捕捉することによって達成される。線形領域内トラッピングも軸方向に約350 nmの拡張するDNA上のすべての光力クランプとして機能します。我々は同時に、細かくカバースリップにこだわった基準微小球が同じ位置とフォーカスのままであるように、ステージの位置を調整することにより、熱的、機械的なドリフトを補償実質的に無限の観察期間のためllowing。

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

我々は、短いDNA分子の機械的性質を探求する一定の力軸光ピンセットの使用を例証します。軸方向にDNAを延伸することによって、私たちは私たちが約100nm限り短くDNA分子を研究できるように、立体障害と、従来の横方向の操作で生じるアーチファクトを最小限に抑えることができます。

コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

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Bioengineering

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