Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
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우리는 축 광학 핀셋과 관련하여 도움이이 원고에게 스트레칭 데이터의 일부를 기여를위한 Dr Yih-팬 첸 감사드립니다. 이 작품은 NSF 부여 PHY-0957293 및 FOCUS 부여 PHY-0114336 후원했다.

1. 핀셋 설정 <ol><li> 1064 nm의 레이저에서 빔은 두 개의 직교 편광 빔으로 분할되어 있습니다. 하나는 다른이 (그림을 참조하십시오. 2) 보정 목적으로 사용되는 동안 생체 분자를 조작하는 데 사용됩니다. </li><li> 각 빔의 위치 및 포커스가 독립적으로 각각 빔 조향 거울과 광학 망원경에 의해 제어되는 동안 조작 빔의 강도는 음향 광학 향기 (AOD)에 의해 제어됩니다. </li><li> 빔 그런 다음 다른 편광 ...

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	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. 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종래의 광 핀셋은 refractile 개체에 일정한 힘을 적용하는 중 아날로그 또는 컴퓨터 제어의 의견에 의존하고 있습니다. 이러한 적극적인 피드백 시스템은 단백질의 바인딩에서 DNA 또는 필라멘트를 따라 분자 모터의 급속한 스테핑으로, 예를 들어, 어려움 표본의 확장의 급격한 변화가 발생할 조건 하에서 수행되어 있습니다. 일정한 힘을 적용하기위한 다양한 수동 방법이 최근 개발되었습니다. base...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 코멘트 </th></tr><tr><td> ND : YVO4 레이저 </td><td> 스펙트럼 물리학 </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> 음향 광학 변류기 </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 목표 </td><td> 하늘 </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1.4 </td></tr><tr><td> 압전 단계 </td><td> 매드시 연구소 </td><td> 나노 LP100 </td><td> XYZ 단계 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> 광 검출기 </td><td> 전기 광학 기술 </td><td> 동부 표준시 - 3020 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리스티렌 비즈 </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm​​, streptavidin 광을 낸 </td></tr><tr><td> 안티 digoxigenin </td><td> 로슈 </TD&gt; <td> 11333089001 </td><td> 양에서 </td></tr><tr><td> 프리 머 </td><td> MWG 오페론 </td><td> 사용자 oligos </td><td> 하나의 뇌관 : 비오틴 기타 : digoxigenin </td></tr><tr><td> PCR 시약 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> DNA 형성 촉매의 효소 dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에 대한 다른 화학 물질 버퍼 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 보충 자료 A. 유체 마찰 계수 표면 근처 microsphere의 유체 마찰 계수를 결정하는 사람은 다음과 같은 확장 5,10를 사용할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="수식 1" /> 있는 다음과 같은 속기 H로 도입되었습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="수식이" /> 마찰 계수는 표면 위에 거리 η에 위치한 microsphere의 중심으로, 유체 점성 η과 microsphere의 반지름의 관점에서 정의됩니다. 십년 쯤 조건에 확장 할 때 합류가 합리적으로 잘 converges. 강성 보정에 축 방향 위치의 B.의 영향 트랩 강성의 교정 표면에서 증가 거리를 증가 교정의 정확성, 그리고 함정이 실험적으로 사용되는 실제 축 위치 사이의 효율이 줄어을 포함한다. 일반적으로 트랩이 실제 실험 조건보다 더 높은 표면, 800-1000 nm의 주위에 교정된다. C.는 웜 형태의 체인 (WLC) 모델을 수정 힘 확장 곡선은 수정 WLC m에 맞게 할 수 있습니다odel이 다음과 같이 제로 광학 힘에 볼륨 제외 효과를위한 계정 : <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="수식 3" /> F 선택은 광학 힘이고, X O는 영 힘 확장에 적합한 매개 변수이며, X 선택이 힘을 아래의 확장, 전 DNA의 윤곽 길이이며, L * P는 &quot;효과에 대한 두 번째 적합한 매개 변수입니다 &quot;지속성 길이. F wlc 일반적인 WLC 모델 11에 의해 주어진다 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="수식 4" /> 위치 ε 상대 DNA 확장입니다.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

이하 kilobase보다 윤곽 길이의 DNA에 이르는위한 단일 분자 기술은 실험 어려움이 따른다 있습니다. 그러나, 이러한 히스톤 구속력과 DNA 1,2의 단백질로 인한 루핑 등 여러 흥미로운 생물학적 이벤트가,이 길이 규모 발생합니다. 최근에는 DNA의 기계적 성질은 소형 nucleosomes와 염색질 섬유 3,4로 DNA의 패키징과 같은 기본적인 세포 과정에 중요한 역할을하는 표시되었습니다. 분명 DNA의 짧은 뻗어의 기계적 성질을 이해 한 후 중요합니다. 이 논문에서, 우리는 몇 백 basepairs 짧은 등의 윤곽 길이와 DNA의 기계적 동작을 연구 개발 한 단일 분자 광 tweezing 기술에 실질적인 가이드를 제공합니다. DNA의 짧은 세그먼트를 스트레칭의 주요 장애물은 기존의 광 핀셋은 일반적으로 directio에 힘을 적용하도록 설계되어 있습니다N 무대 5,6에 측면 (그림을 참조하십시오. 1). 이 구조에서, 구슬과 coverslip 사이의 각도는, 그 DNA가 묶여있다하기 위해, submicron의 길이 DNA 매우 가파른됩니다. 축 위치는 현재 확장 가까이 coverslip에 microsphere를 끌 때문에, steric 효과가 향상되고 도전이 될 수있는 차지, 그리고해야합니다. 또한, 마이크로의 비대칭의 결과로, 측면 확장 생성합니다 확장 중에 반응성 힘 변화의 방향부터 광학 트랩 내에 인해 microsphere의 회전에 토크의 수준을 변화. 스트레칭 submicron의 DNA에 대한 대체 방법은 자신의 고유 한 장애물에 반대하는 실행합니다. 예를 들어, 듀얼 빔 광학 트랩이되는 두 트랩 사이 마이크로 사이의 빛의 분산에서 포인트 간섭 효과 큰 문제를 일으킬하기 시작, 파장 주위의 DNA에 이르는으로 제한됩니다. 트랩 중 하나를 교체micropipette으로 가능성이 가장 높은 유사한 문제로 고통 것입니다. 사람이 직접 D​​NA을 향상시킬 수있는 축 잠재력을 사용할 수 있지만, 적극적인 피드백 체계는 일정한 힘이의 대역폭은 특히 낮은 힘에서 매우 제한됩니다를 적용 할 필요됩니다. 우리는 직접 일정한 힘을 축 광학 핀셋 7,8를 사용하여 coverslip에서 떨어져 DNA를 당겨 이러한 근본적인 문제를 회피. 이 문제는 광학 힘이 일정한 힘있는이 레이저 파워를 조정하여 조정 될 수 있습니다 광학 가능성 선형 지역의 구슬을 수집에 의해 달성된다. 선형 영역 내에 트래핑은 또한 축 방향으로 약 350 나노 미터에 대한 확장 DNA에 모든 광학 힘 - 클램프 역할을합니다. coverslip에 붙어 참조 microsphere가 동일한 위치와 초점에 남아 있도록 동시에 정교하게 무대의 위치를​​ 조정하여 열 및 기계적 드리프트 보상거의 무한 관찰 기간 동안 llowing.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

우리는 짧은 DNA 분자의 기계적 성질을 탐험 할 수있는 일정한 힘을 축 광 핀셋의 사용을 보여줍니다. 축 방향으로 DNA를 스트레칭함으로써, 우리는 우리 ~ 100 nm의 짧은으로 DNA 분자를 연구 할 수 있습니다 steric hindrances 및 종래의 측면 조작하여 발생하는 유물을 최소화합니다.

상수 강제 축 방향 광학 족집게로 DNA의 짧은 시퀀스를 스트레칭

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

연구

생체공학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 공동 축류 초점 장치를 사용하여 이중 에멀젼 생성

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...