Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
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Agradecemos ao Dr. Yih-Fan Chen ajuda com as pinças ópticas axiais e contribuir alguns de seus dados de alongamento para este manuscrito. Este trabalho foi patrocinado pela NSF concessão PHY-0957293 e concessão FOCUS PHY-0114336.

1. Pinças Setup <ol><li> O feixe de um laser 1064 nm é dividida em dois feixes polarizados ortogonalmente. Um é utilizado para manipular a biomolécula, enquanto o outro é usado para fins de calibração (ver a Fig. 2.). </li><li> A intensidade do feixe de manipulação é controlada por um deflector acústico-óptico (AOD), enquanto que a posição de focagem e de cada feixe é controlada de forma independente por espelhos de feixe de direcção e telescópios ópticos, respectivamente. </li><li> Os feixes são e...

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	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. 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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Pinças ópticas convencionais dependem tanto de feedback analógico ou controlado por computador para aplicar uma força constante sobre um objecto refrangente. Estes sistemas de retroalimentação activas têm dificuldade em realizar, em condições em que as alterações súbitas na extensão do espécime ocorrem, por exemplo, a partir da ligação de uma proteína ao ADN ou a intensificação rápida de um motor molecular ao longo de um filamento. Vários métodos para a aplicação de forças passivas constantes fo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Laser Nd: YVO4 </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Óptico-acústico defletor </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo microscópio </td><td> Olimpo </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Fase Piezo </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> Estágio XYZ </td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Fotodetector </td><td> Electro-Optics Tecnologia </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Esferas de poliestireno </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, estreptavidina revestido </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> De ovelhas </td></tr><tr><td> Iniciadores </td><td> MWG operon </td><td> Oligos personalizados </td><td> Um primer: biotina Outros: digoxigenina </td></tr><tr><td> PCR reagentes </td><td> Nova Inglaterra Biolabs </td><td> Taq polimerase, dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Lamela </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Outros produtos químicos para amortecer </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Materiais suplementares A. Coeficiente de Fricção hidrodinâmica Para determinar o coeficiente de atrito hidrodinâmico da microesfera perto de uma superfície pode-se utilizar os 5,10 expansão seguintes: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Equação 1" /> onde o h abreviada a seguircomo foram introduzidos: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Equação 2" /> O coeficiente de atrito é definido em termos de fluido de viscosidade η e o raio da microesfera, com o centro da microesfera, localizada a uma distância acima da superfície η. A soma converge razoavelmente bem quando expandido para cerca de 10 termos. B. Influência da posição axial em Calibração Rigidez A calibração da rigidez armadilha envolve uma troca entre a precisão da calibração, que aumenta com o aumento da distância a partir da superfície, e a posição real axial onde a armadilha é usada experimentalmente. Em geral, a armadilha é calibrado em cerca de 800-1000 nm a partir da superfície, que é maior do que a verdadeira condição experimental. C. Modificado Worm-Like Cadeia Modelo (WLC) As curvas de extensão da força pode ser ajustado a um WLC modificada modelo que as contas para efeitos de volume de exclusão em vigor óptico zero, como segue: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Equação 3" /> em que F é a força opt óptico, o x é um parâmetro de ajuste para a extensão de força zero, x é a extensão opt em vigor, l é o comprimento do contorno do DNA, e l * p é um parâmetro de ajuste para uma segunda eficaz &quot; &quot;comprimento de persistência. wlc F é dada pelo modelo habitual WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Equação 4" /> onde ε é a extensão de DNA relativo.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Molécula única de técnicas de alongamento de ADN de comprimentos de contorno inferior a uma kilobase estão repletas de dificuldades experimentais. No entanto, muitos interessantes eventos biológicos tais como a ligação histona e proteínas mediada por looping de ADN a 1,2, ocorrem nesta escala de comprimento. Nos últimos anos, as propriedades mecânicas do ADN têm sido mostrados para desempenhar um papel importante em processos celulares fundamentais como a embalagem do ADN em nucleossomas compactos e fibras de cromatina 3,4. Claramente, é então importante compreender as propriedades mecânicas dos trechos curtos de DNA. Neste artigo, apresentamos um guia prático para uma técnica de uma única molécula de óptica tweezing que temos desenvolvido para estudar o comportamento mecânico de DNA com comprimentos de contorno tão curtos quanto a algumas centenas de pares de bases. O grande obstáculo no alongamento pequenos segmentos de DNA é que convencionais pinças ópticas são geralmente projetados para aplicar a força em um direction lateral ao estágio 5,6, (ver fig. 1). Nesta geometria, o ângulo entre o rebordo e as lamelas, para o qual o DNA é presa, torna-se muito íngremes para submicron DNA comprimento. A posição axial deve agora ser considerado, que pode ser um desafio, e, uma vez que a extensão da microesfera arrasta mais perto da lamela, efeitos estéricos são melhoradas. Além disso, como resultado da assimetria das microesferas, as extensões laterais irá gerar vários níveis de binário devido à rotação da microesfera no interior da armadilha óptica uma vez que a direcção das variações de força reactiva durante a extensão. Métodos alternativos para DNA submicron alongamento correr até contra seus próprios obstáculos únicos. Por exemplo, uma armadilha de duplo feixe óptico é limitada ao estiramento DNA de cerca de um comprimento de onda, em que os efeitos de interferência entre os pontos de duas armadilhas e de dispersão da luz entre as microsferas começam a ser um problema significativo. Substituindo uma das armadilhascom uma micropipeta provavelmente sofrem de desafios semelhantes. Embora se possa utilizar directamente o potencial axial para alongar o DNA, um esquema de feedback ativo que seria necessário para aplicar uma força constante e a largura de banda que será bastante limitado, especialmente em baixas forças. Nós contornar esses problemas fundamentais diretamente puxando o DNA de distância da lamínula usando uma força constante axial pinças ópticas 7,8. Isto é conseguido prendendo o grânulo em uma região linear do potencial óptico, em que a força óptica é constante, a força que pode ser ajustada através do ajuste da potência do laser. Prendendo dentro da região linear também serve como um todo óptico força de fixação sobre o ADN que se estende por cerca de 350 nm no sentido axial. Nós simultaneamente compensar o desvio térmico e mecânico com a ajustar com precisão a posição da fase de modo a que uma microesfera referência preso à lamela permanece na mesma posição e foco, umllowing para um período de observação de praticamente ilimitadas.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengenharia

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Alongamento Células micropatterned num PDMS Membrana

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...