Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Мы благодарим доктора Yih-Fan Chen за помощь в осевой оптический пинцет и за вклад некоторых из его растяжения данных в этой рукописи. Эта работа была организована NSF гранта PHY-0957293 и FOCUS гранты PHY-0114336.

1. Пинцет установки <ol><li> Излучение 1064 нм лазера расщепляется на два ортогонально поляризованных пучков. Один используется для манипулирования биомолекулы, а другой используется для калибровки (см. рис. 2). </li><li> Интенсивность манипуляций пучка контролируется акустооптического дефлек?...

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Обычные оптические пинцеты полагаться на аналоговые или с компьютерным управлением обратной связью, чтобы применить силу на постоянной рефрактильных объекта. Эти системы активной обратной связью испытывают трудности выполнения в условиях, когда внезапные изменения в расширение обр...

<table border="1"><tbody><tr><th> Реагент / Оборудование </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> Nd: YVO4 лазер </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Акустооптическая дефлектор </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Объектива микроскопа </td><td> Олимп </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Piezo этапе </td><td> Mad City Labs </td><td> Нано-LP100 </td><td> XYZ этапе </td></tr><tr><td> ПЗС-камеры </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Фотоприемник </td><td> Electro-Optics Tech </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Полистирол бусины </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, стрептавидин покрытый </td></tr><tr><td> Anti-дигоксигенин </td><td> Roche </TD&gt; <td> 11333089001 </td><td> От овец </td></tr><tr><td> Грунтовки </td><td> MWG оперона </td><td> Пользовательские олиго </td><td> Один грунтовки: биотин Прочие: дигоксигенин </td></tr><tr><td> ПЦР реагенты </td><td> Новая Англия Biolabs </td><td> TAQ полимеразы, дНТФ </td><td></td></tr><tr><td> Покровного стекла </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Другие химические вещества для буфера </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Дополнительные материалы А. Гидродинамический коэффициент трения Для определения гидродинамических коэффициентов трения микросфер вблизи поверхности можно использовать следующую 5,10 расширения: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Уравнение 1" /> где следующий ч сокращеннуюкак были введены: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Уравнение 2" /> Коэффициент трения определяется в терминах вязкости жидкости η и радиуса микросфер с центром микросферы, расположенные на расстоянии η над поверхностью. Суммирование сходится достаточно хорошо, когда расширилась до десяти условия. B. Влияние осевой жесткости позиции по калибровке Калибровка ловушку жесткость включает в себя компромисс между точность калибровки, которая увеличивается с ростом расстояния от поверхности, а фактическое осевое положение, в котором ловушки используются экспериментально. В общем, ловушка откалиброван в пределах 800-1000 нм от поверхности, что выше, чем фактические экспериментальные условия. C. изменения червеобразного сети (WLC) модели Кривые силы расширения может быть установлен на изменение WLC мОдел, который учитывает объемы исключения эффектов при нулевой оптической силой следующим образом: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Уравнение 3" /> где F выбирают является оптическая сила, X O является нужным параметром для нулевого расширения силой, х выбирают является расширение под силу, л контур длины ДНК, и л р * Второй параметр, пригодный для «эффективной «сохранением длины. F WLC дается обычной модели WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Уравнение 4" /> где ε является относительное удлинение ДНК.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Проиллюстрируем использование постоянной силы осевой оптический пинцет для изучения механических свойств коротких молекул ДНК. По растяжение ДНК оси, мы минимизируем стерических помех и артефактов, возникающих в обычных боковых манипуляции, позволяющие нам изучать молекулы ДНК максимально коротким ~ 100 нм.

Растяжение коротких последовательностей ДНК с постоянной силой осевой оптический пинцет

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Визуализация рекомбинантных ДНК и белковых комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Постоянное давление контролируемый методом экструзии для приготовления наноразмерных липидных везикул

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Количественный оптическая микроскопия: Измерение Cellular биофизических Особенности с использованием стандартного оптического микроскопа

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Магнитные Пинцет для измерения Twist и крутящий момент

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Наноманипулирование Единого РНК молекул на оптический пинцет

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Двухместный Эмульсия поколения Использование Полидиметилсилоксан (PDMS) Коаксиальная Поток Фокус устройства

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...