Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
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Agradecemos al Dr. Yih-Fan Chen para ayudar con las pinzas ópticas axial y para contribuir a algunos de sus datos se extiende a este manuscrito. Este trabajo fue patrocinado por la NSF conceder PHY-0957293 y FOCUS conceder PHY-0114336.

1. Pinzas de configuración <ol><li> El haz de un láser de 1064 nm se divide en dos rayos polarizados ortogonalmente. Uno se utiliza para manipular la biomolécula, mientras que el otro se usa para fines de calibración (ver fig. 2). </li><li> La intensidad del haz de la manipulación se controla mediante un deflector acústico-óptica (AOD), mientras que la posición y la orientación de cada haz se controla de forma independiente por los espejos de orientación del haz y los telescopios ópticos, respectivamente. <...

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. 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N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Pinzas ópticas convencionales se basan en información ya sea analógico o controlados por ordenador para aplicar una fuerza constante en un objeto refractantes. Estos sistemas de captación activa tiene dificultades para realizar en condiciones en que los cambios repentinos en la extensión de la muestra se producen, por ejemplo, de la unión de una proteína en el ADN o la intensificación rápida de un motor molecular a lo largo de un filamento. Varios métodos pasivos para la aplicación de fuerzas constantes se ha...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Reagent/Equipment</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalog number</th>
			<th>Comments </th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YVO4 laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>T40-Z-106C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optic deflector</td>
			<td>IntraAction</td>
			<td>DTD-274HA6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanApo </td>
			<td>60X, NA 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>Nano-LP100</td>
			<td>XYZ stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>PixeLink</td>
			<td>PL-A741</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodetector</td>
			<td>Electro-Optics Tech</td>
			<td>ET-3020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-08-10</td>
			<td>800nm, streptavidin coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11333089001</td>
			<td>From sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>MWG operon</td>
			<td>Custom oligos</td>
			<td>One primer: biotin 
Other : digoxigenin 
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR reagents</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>TAQ polymerase, dNTPs</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals for buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction Coefficient
For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10: 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Equation 1" />
where the following shorthand has been introduced: 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Equation 2" />
The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity &eta; and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance &eta; above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows: 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Equation 3" />
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Equation 4" /> 
where &epsilon; is the relative DNA extension.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Una sola molécula de técnicas para estirar el ADN de longitudes de curvas de nivel a menos de un kilobase están llenos de dificultades experimentales. Sin embargo, muchos eventos interesantes biológicos tales como la unión de histonas y proteínas mediada por un bucle de ADN 1,2, se encuentran en esta escala de longitud. En los últimos años, las propiedades mecánicas de ADN han demostrado que desempeñan un papel importante en los procesos celulares básicos como el empaquetamiento del ADN en los nucleosomas compacto y fibras de cromatina 3,4. Es evidente, entonces es importante entender las propiedades mecánicas de los tramos cortos de ADN. En este artículo, ofrecemos una guía práctica de una técnica de depilación de una sola molécula óptica que hemos desarrollado para estudiar el comportamiento mecánico de ADN con una longitud de contorno tan corto como unos pocos cientos de pares de bases. El principal obstáculo en el estiramiento segmentos cortos de ADN, es que las pinzas ópticas convencionales generalmente están diseñados para aplicar la fuerza en una dirección lateral a la etapa de 5,6, (véase la Fig. 1.). En esta geometría, el ángulo entre el talón y el cubreobjetos, a la que el ADN está conectado al ordenador, se hace muy fuerte de ADN de longitud submicron. La posición axial ahora deben tenerse en cuenta, que puede ser un desafío, y, puesto que la extensión se prolonga la microesfera más cerca del cubreobjetos, efectos estéricos se han mejorado. Por otra parte, como resultado de la asimetría de las microesferas, extensiones laterales se generan distintos niveles de torque debido a la rotación de la microesfera dentro de la trampa óptica desde la dirección de la variación de la fuerza reactiva en la extensión. Métodos alternativos para el estiramiento de ADN submicron ejecutar en contra de sus propias barreras. Por ejemplo, una trampa de doble haz óptico está limitado a un estiramiento del ADN de alrededor de una longitud de onda, en la que los efectos punto de interferencia entre las dos trampas y de dispersión de la luz entre las microesferas empiezan a plantear un problema importante. Sustitución de una de las trampas con una micropipeta más probable es que sufren de problemas similares. Mientras que uno podría utilizar directamente el potencial axial para estirar el ADN, un esquema de retroalimentación activa sería necesario aplicar una fuerza constante y el ancho de banda de esta será muy limitado, especialmente en las fuerzas bajo. Nos evitar estos problemas fundamentales directamente tirar el ADN fuera del cubreobjetos con una fuerza axial constante pinzas ópticas 7,8. Esto se logra atrapar la bola en una región lineal de la posibilidad de óptica, donde la fuerza óptica es constante, la fuerza de la que se pueden ajustar mediante el ajuste de la potencia del láser. Atrapando dentro de la región lineal también sirve como una fuerza todas las ópticas-clamp en el ADN que se extiende por cerca de 350 nm en la dirección axial. Simultáneamente, compensar la desviación térmica y mecánica finamente ajustar la posición de la etapa para que una microesfera de referencia pegado a la cubreobjetos se mantiene en la misma posición y el enfoque, lo que permite un período de observación prácticamente ilimitadas.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Se ilustra el uso de una fuerza constante pinzas ópticas axial para explorar las propiedades mecánicas de las moléculas cortas de ADN. Por el estiramiento del ADN axialmente, podemos minimizar los obstáculos estéricos y artefactos procedentes de la manipulación lateral convencional, lo que nos permite estudiar las moléculas de ADN tan corto como ~ 100 nm.

Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Investigación

Bioingeniería

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

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Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

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Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

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El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

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Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

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Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

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Generación de doble emulsión utilizando un flujo Focus Dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-axial

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...