Name: stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers
Uploaded: 2011-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Vi tackar Dr Yih-Fan Chen för att få hjälp med de axiella optisk pincett och för att bidra några av hans stretching data till detta manuskript. Detta arbete sponsrades av NSF bevilja PHY-0957293 och Focus bidrag PHY-0.114.336.

1. Pincett inställning <ol><li> Strålen från en 1064 nm laser uppdelas i två ortogonalt polariserade strålar. En används för att manipulera biomolekylen medan den andra används för kalibrering (se Fig. 2). </li><li> Intensiteten av manipulering strålen styrs av en akusto-optisk deflektor (AOD), medan positionen och inriktningen hos varje stråle regleras oberoende av speglar strålstyrning och teleskop, respektive. </li><li> Balkarna sedan återförenas med en annan polariserande stråldelare och konditioner...

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Konventionella optisk pincett åberopa antingen analog eller datorstyrd återkoppling att applicera en konstant kraft på en ljusbrytande föremål. Dessa aktiva återkopplade system har svårt att utföra under förhållanden där plötsliga ändringar i förlängningen av provet inträffar, till exempel, från bindningen av ett protein till DNA eller snabb stegning av en molekylär motor längs en glödtråd. Olika passiva metoder för att tillämpa konstanta krafter har nyligen utvecklats. En sådan metod, som använ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens / utrustning </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> Nd: YVO4 laser </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Akusto-optisk deflektor </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Mål </td><td> Olympus </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1,4 </td></tr><tr><td> Piezo steg </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> XYZ skede </td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Fotodetektor </td><td> Elektrooptik Tech </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyrenpärlor </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidin belagd </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> Från får </td></tr><tr><td> Primers </td><td> MWG operonet </td><td> Anpassade oligos </td><td> En primer: biotin Andra: digoxigenin </td></tr><tr><td> PCR-reagens </td><td> New England Biolabs </td><td> Taq-polymeras, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Andra kemikalier för buffert </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Kompletterande material A. Hydrodynamisk friktionskoefficient För bestämning av hydrodynamiska friktionskoefficient av mikrosfären nära en yta kan man använda följande expansionen 5,10: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Ekvation 1" /> där följande förkortning hsåsom införts: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Ekvation 2" /> Friktionskoefficienten definieras i termer av vätskans viskositet η och radien av mikrosfären, med mikrosfären centrum beläget ett avstånd η ovanför ytan. Summeringen konvergerar ganska bra när expanderat till omkring tio termer. B. Inverkan av axiell position på Styvhet Kalibrering Kalibreringen av fällan styvheten innebär en kompromiss mellan noggrannheten av kalibreringen, vilket ökar med ökande avstånd från ytan, och den faktiska axiella läge där fällan används experimentellt. I allmänhet kalibreras fällan vid cirka 800-1000 nm från ytan, vilket är högre än det faktiska experimentella tillståndet. C. Modifierad maskliknande Chain (WLC) Modell The Force förlängning kurvorna kan passa till en modifierad WLC mOdel som står för effekter volym utslagning på noll optisk kraft enligt följande: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Ekvation 3" /> där F opt är den optiska kraften, X är O en lämplig parameter för noll kraften förlängningen, är x välja en förlängning under kraft, är l kontur längden av DNA, och l * p är ett andra passform parameter för en &quot;effektiv &quot;persistens längd. K WLC ges av vanliga WLC modellen 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Ekvation 4" /> där ε är den relativa DNA-förlängning.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Enda molekyl tekniker för stretching DNA kontur längder mindre än en kilobas är förenat med experimentella svårigheter. Men många intressanta biologiska händelser som histon bindning och protein-medierad looping av DNA 1,2, uppträder på denna längd skala. Under de senaste åren, har de mekaniska egenskaperna hos DNA som visats spela en viktig roll i fundamentala cellulära processer såsom förpackning av DNA i kompakta nukleosomer och kromatin fibrer 3,4. Uppenbarligen är det då viktigt att förstå de mekaniska egenskaperna hos korta sträckor av DNA. I detta dokument ger vi en praktisk guide till en enda molekyl optisk tweezing teknik som vi har utvecklat för att studera den mekaniska beteendet hos DNA med kontur längder så korta som några hundra baspar. Den stora hinder i stretching korta segment av DNA är att konventionella optiska pincetter är i allmänhet utformade för att tillämpa kraft i en direction sidled till scenen 5,6, (se Fig. 1). I denna geometri, blir vinkeln mellan vulsten och täckglaset, till vilken DNA är tjudrad, mycket branta för submikron längd-DNA. Det axiella läget måste nu redovisas, vilket kan vara en utmaning, och eftersom förlängningen drar mikrosfär närmare täckglas är steriska effekter förstärks. Vidare, som ett resultat av asymmetrin hos mikrosfärerna, kommer sidoförlängningar genererar varierande vridmoment på grund av rotationen av mikrosfären i den optiska fällan eftersom riktningen av de reaktiva kraften förändras under förlängningen. Alternativa metoder för att sträcka submikron DNA stöter sina egna unika hinder. Till exempel är en dubbel-stråle optisk fälla begränsad till sträckning DNA av omkring en våglängd, vid vilken punkt interferenseffekter mellan de två fällor och från ljusspridning mellan mikrosfärerna börjar utgöra ett signifikant problem. Ersätta en av fällornamed en mikropipett skulle sannolikt lider av liknande problem. Medan man kan direkt använda den axiella potentialen att sträcka DNA skulle en aktiv återkoppling system behövas för att tillämpa en konstant kraft och bandbredden av detta kommer att vara ganska begränsad, särskilt vid låga krafter. Vi kringgå dessa grundläggande problem genom att direkt dra av DNA från täckglaset genom att använda en konstant kraft axiellt optisk pincett 7,8. Detta uppnås genom att fånga pärlan i en linjär region av optiska potentialen, där den optiska kraften är konstant styrka som kan avstämmas genom justering av lasereffekten. Fångst inom det linjära området fungerar också som en allt optisk kraft-klämman på det DNA som sträcker sig nästan 350 nm i den axiella riktningen. Vi kompenserar samtidigt för termisk och mekanisk drift av fint justering av scenen så att en hänvisning mikrosfär fastnat på täckglas kvar på samma position och fokus, enllowing en praktiskt taget obegränsad observationsperiod.

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Vi illustrerar användningen av en konstant kraft axiell optisk pincett att utforska de mekaniska egenskaperna hos korta DNA-molekyler. Genom att sträcka DNA axiellt, minimerar vi steriska hinder och artefakter som uppstår vid konventionell lateral manipulation, vilket tillåter oss att studera DNA-molekyler så korta som ~ 100 nm.

Stretching korta sekvenser av DNA med konstant kraft Axial optisk pincett

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisering av Rekombinant DNA och proteinkomplex Använda atomkraftsmikroskopi

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Konstant tryck kontrollerad Extrusion metod för framställning av Nano-storlek lipidvesiklar

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Kvantifiering De mekaniska egenskaperna hos den endoteliala glykokalyx med atomkraftsmikroskopi

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Undersöka Receptor-ligand System av Cellulosome med AFM-baserad Single-molekyl Force spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Kvantitativ optisk mikroskopi: Mätning av Cellular biofysikalisk funktioner med en standard optisk mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Stretching Micropatterned Celler på en PDMS membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Magnetiska pincett för Mätning av Twist och vridmoment

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation av Single-RNA-molekyler med optisk pincett

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Använda en Polydimetylsiloxan (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...