Name: monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00
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Les auteurs sont soutenus par le Conseil de recherche suédois, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique, la société du cancer suédois, la société suédoise de l&#39;enfant le cancer, Wibergs Åke fondation et Jeanssons fondation.

1. Introduire la sonde à cellules <ol><li> Co-transfection de cellules avec une sonde FRET base et une résistance plasmidique conférant. Choisissez une méthode de transfection qui est efficace dans votre cellule-type d&#39;intérêt. Pour les cellules U2OS, les méthodes classiques de transfection de phosphate de calcium donnent des résultats adéquats 15. </li><li> Sélectionnez les cellules dans l&#39;antibiotique approprié pendant au moins sept jours. Ceci enrichit la quantité de cellules expriman...

<ol>
	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

Surveillance de FRET au long du cycle cellulaire nécessite des considérations qui sont moins cruciales lors de l&#39;évaluation à court terme des réponses à des stimuli externes. Tout d&#39;abord, la progression du cycle cellulaire est facilement perturbée par la signalisation du stress, exigeant que la phototoxicité est maintenu à un minimum. Deuxièmement, tous les journalistes peuvent potentiellement affecter les processus cellulaires en titrant sur les kinases, les phosphatases ou des domaines d&#39;interac...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Société </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15, pas de rouge de phénol </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, par Life Technologies </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO, par Life Technologies </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO, par Life Technologies </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

Förster résonance de transfert d&#39;énergie (FRET) basé sur une reporters permettre l&#39;évaluation de la kinase endogène et activités phosphatase dans des cellules vivantes. Ces sondes sont généralement constitués de variantes du CFP et YFP, est intervenu par une séquence phosphorylable et un domaine phospho-contraignant. Après phosphorylation, la conformation sonde change, ce qui entraîne un changement de la distance ou l&#39;orientation entre le CFP et YFP, conduisant à un changement dans l&#39;efficacité de FRET (Fig 1). Plusieurs sondes ont été publiés durant la dernière décennie, la surveillance de l&#39;équilibre d&#39;activité des kinases et phosphatases multiples, y compris les journalistes de la PKA 2, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 et 9 PLK1 . Compte tenu de la conception modulaire, les sondes supplémentaires sont susceptibles d&#39;émerger dans le proche avenir 10. La progression dans le cycle cellulaire est affectée par le stress signaling voies 11. Notamment, le cycle cellulaire est régulée différemment pendant imperturbable croissance par rapport à quand les cellules se remettent du stress 12. Imagerie time-lapse de cellules dans le cycle cellulaire nécessite donc des précautions particulières. Cela devient un problème particulier lors de l&#39;utilisation d&#39;imagerie ratiométrique, puisque deux images avec un signal élevé par rapport au bruit sont nécessaires pour interpréter correctement les résultats. Ratiométrique FRET imagerie des modifications du cycle cellulaire dépendante des activités kinase et phosphatase a essentiellement été limité à des sous-sections du cycle cellulaire 8,9,13,14. Ici, nous discutons d&#39;une méthode pour surveiller FRET basée sur des sondes à l&#39;aide d&#39;imagerie ratiométrique au long du cycle cellulaire humain. La méthode repose sur l&#39;équipement qui est disponible pour de nombreux chercheurs en sciences de la vie et ne nécessite pas de connaissances d&#39;experts de la microscopie ou de traitement d&#39;image.

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Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

FRET basée sur les journalistes sont de plus en plus utilisées pour suivre les activités kinases et de phosphatases dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici une méthode sur la façon d&#39;utiliser FRET basé journalistes afin d&#39;évaluer le cycle cellulaire dépendante des changements dans la phosphorylation cible.

Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Research

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Biology

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Dessin de sang de rats à travers la veine saphène et par ponction cardiaque

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Recherche

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Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

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FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

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Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

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Synchronisation de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

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Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

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Approches expérimentales pour l&#39;étude mitochondrial Localisation et fonction d&#39;une cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l&#39;aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

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Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...