Name: monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00
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Die Autoren sind vom schwedischen Forschungsrat, die Schwedische Stiftung für strategische Forschung, dem schwedischen Cancer Society, der schwedischen Kinder-Krebs-Gesellschaft, Åke Wibergs Stiftung und Jeanssons Stiftung unterstützt.

1. Die Einführung der Sonde in Zellen <ol><li> Co-Transfektion von Zellen mit einer FRET-basierten Sonde und ein Plasmid Resistenz. Wählen Sie eine Transfektion Methode, die effizient in Ihr Handy-Typ von Interesse. Für U2OS Zellen, geben Standard-Calciumphosphat-Transfektion Methoden angemessene Ergebnisse 15. </li><li> Markieren Sie die Zellen in dem entsprechenden Antibiotikum für mindestens 7 Tage. Dies bereichert die Menge an Zellen, die die Sonde und begrenzt die Menge an Zellen mit toxischen Expr...

<ol>
	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

Überwachung FRET während des Zellzyklus erfordert Überlegungen, die weniger wichtig sind bei der Beurteilung der kurzfristigen Reaktionen auf äußere Reize. Zuerst wird das Fortschreiten des Zellzyklus leicht gestört durch Stress-Signalisierung, verlangen, dass Phototoxizität auf ein Minimum gehalten wird. Zweitens können alle Reporter möglicherweise beeinflussen zelluläre Prozesse durch Titration aus Kinasen, Phosphatasen oder Interaktion Domains. Der wohl einfachste Weg, um zu beurteilen, wenn die experimente...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Firma </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15, kein Phenolrot </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO von Life Technologies </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO von Life Technologies </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO von Life Technologies </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierten Reportern 1 erlauben die Beurteilung der endogenen Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen. Solche Sonden bestehen typischerweise aus Varianten von GFP und YFP, durch eine phosphorylierbaren Sequenz und einer phospho-bindende Domäne eingegriffen. Nach der Phosphorylierung FRET der Sonde ändert Konformation, die zu einer Veränderung des Abstandes oder der Orientierung zwischen CFP und YFP Ergebnisse, die zu einer Veränderung der Effizienz (Abb. 1). Mehrere Sonden haben in den letzten zehn Jahren veröffentlicht worden, die Überwachung der Aktivität Balance mehrerer Kinasen und Phosphatasen, darunter Reporter von PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, Cdk 18, Aurora B 9 und Plk1 9 . Angesichts des modularen Aufbaus sind zusätzliche Sonden wahrscheinlich in naher Zukunft 10 austreten. Progression durch den Zellzyklus wird durch Stress signali betroffenng Wege 11. Bemerkenswert ist, dass der Zellzyklus unterschiedlich während ungestörte Wachstum im Vergleich zu, wenn die Zellen vor Stress erholt 12 geregelt. Zeitraffer-Bildgebung von Zellen durch den Zellzyklus erfordert daher besondere Vorsicht. Dies wird zu einem Problem vor allem beim Einsatz ratiometrische Bildgebung, da zwei Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erforderlich sind, um richtig zu interpretieren die Ergebnisse. Ratiometric FRET Bildgebung von Zell-Zyklus abhängig Veränderungen im Bereich der Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten vorwiegend muss Teilbereiche des Zellzyklus 8,9,13,14 beschränkt. Hier diskutieren wir eine Methode zur FRET-Sonden mit ratiometrische Bildgebung in der gesamten menschlichen Zellzyklus kontrollieren. Die Methode stützt sich auf die Einrichtungen, zur Verfügung zu viele Forscher in den Biowissenschaften ist und erfordert keine Fachkenntnisse der Mikroskopie oder Bildverarbeitung.

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Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing Blood von Ratten durch die Vena saphena und durch Herzpunktion

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Forschung

Biologie

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...