Name: monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET at JoVE.com

Авторы при поддержке Шведского исследовательского совета, Шведский фонд стратегических исследований, шведское общество рака, шведском обществе раком ребенка, Оке Wibergs фундамент и Jeanssons фундамент.

1. Введение зонда в клетки <ol><li> Сотрудничество трансфекции клеток с FRET основе зонда и плазмиды присвоении сопротивления. Выберите трансфекции метод, который эффективен в вашей камерного типа, представляющих интерес. Для ячеек U2OS, стандартные методы фосфатом кальция трансфекции дают ?...

<ol>
	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

Мониторинг FRET протяжении клеточного цикла требует соображения, которые являются менее важно при оценке краткосрочных ответов на внешние раздражители. Во-первых, прогрессию клеточного цикла легко возмущенного стресс сигнализации, требуя, чтобы фототоксичности сведено к минимуму. Во-?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Номер по каталогу </td><td> Компания </td></tr><tr><td> Лейбовиц L-15, без фенола красного </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, по Life Technologies </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO, по Life Technologies </td></tr><tr><td> Эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> Hyclone </td></tr><tr><td> 0,05% трипсина ЭДТА </td><td> SH30236.01 </td><td> Hyclone </td></tr><tr><td> Пенициллин-Стрептомицин </td><td> SV30010 </td><td> Hyclone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO, по Life Technologies </td></tr><tr><td> Пуромицин </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

Ферстер резонанс переноса энергии (FRET)-основанной журналистам 1 позволяют оценка эндогенной киназы и фосфатазы деятельность в живых клетках. Такие зонды обычно состоят из вариантов CFP и YFP, вмешался phosphorylatable последовательности и фосфорно-связывающий домен. После фосфорилирования, конформации зонд изменения, что приводит к изменению расстояния или ориентации между CFP и YFP, что приводит к изменению FRET эффективности (рис. 1). Несколько зондов были опубликованы в течение последнего десятилетия, мониторинг активности баланс нескольких киназ и фосфатаз, в том числе журналисты ПКА 2, ПКБ 3, РКС 4, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, Cdk 18, Aurora B 9 и 9 Plk1 . С учетом модульной конструкции, дополнительными зондами, будут возникать и в ближайшем будущем 10. Прогрессия через клеточный цикл влияет стресс signaliнг пути 11. Примечательно, что клеточный цикл регулируется по-разному в невозмущенной рост по сравнению с когда клетки восстанавливается после стресса 12. Покадровый изображений клеток через клеточный цикл, следовательно, требует особой осторожности. Это становится проблемой, особенно при использовании логометрических изображений, так как два изображения с высоким отношением сигнал-шум должны правильно интерпретировать результаты. Логометрический FRET изображений клеточного цикла зависимые изменения в киназы и фосфатазы деятельность имеет преимущественно ограничивалась подразделы клеточного цикла 8,9,13,14. Здесь мы рассмотрим метод мониторинга FRET основе использования зондов логометрических изображения по всему человеческому клеточного цикла. Метод основан на оборудование, которое доступно для многих исследователей в области биологических наук и не требует специальных знаний микроскопии или обработки изображений.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET at JoVE.com

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

FRET основе репортеры все чаще используются для контроля киназы и фосфатазы деятельность в живых клетках. Здесь мы опишем метод, как использовать FRET основе журналистам для оценки клеточного цикла зависит от изменений в целевую фосфорилирования.

Мониторинг киназы и фосфатазы деятельности путем клеточного цикла Логометрический FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Взятии крови у крыс путем подкожной вены и пункции сердца

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Изучение ДНК Looping на одиночных молекул FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Синхронизация<em&gt; Caulobacter Crescentus</em&gt; По расследованию бактериального клеточного цикла

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Временная Отслеживание клеточного цикла прогрессии Использование проточной цитометрии без необходимости синхронизации

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Белково-селективные GPCR Конформации Измеряется с использованием FRET датчиков в прямом эфире клеточной суспензии Флуорометр Пробирной

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Сочетание митотическая клеток синхронизации и конфокальная микроскопия высокого разрешения для изучения роли многофункциональный клеточного цикла белков во время митоза

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...