Name: monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00
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Los autores se apoyan en la investigación sueca del Consejo, la fundación sueca para la investigación estratégica, la Sociedad Sueca del Cáncer, la sociedad del cáncer infantil sueco, Ake Wibergs y la Fundación Jeanssons.

1. La introducción de la sonda a las células <ol><li> Co-transfectar células con una sonda FRET y basado en un plásmido de resistencia que confieren. Elegir un método de transfección que sea eficiente en su celda de tipo de interés. Para las células U2OS, estándar de calcio métodos de transfección de fosfato dan resultados adecuados 15. </li><li> Seleccione las celdas en el antibiótico apropiado para al menos siete días. Esto enriquece la cantidad de células que expresan la sonda y limita la c...

<ol>
	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

Monitoreo FRET todo el ciclo celular requiere de consideraciones que son menos importantes cuando se evalúa a corto plazo respuestas a los estímulos externos. En primer lugar, progresión del ciclo celular es fácilmente perturbada por las señales de estrés, lo que requiere que la fototoxicidad se mantiene al mínimo. En segundo lugar, todos los periodistas pueden afectar los procesos celulares en la titulación de quinasas, fosfatasas o dominios de la interacción. La forma en que probablemente más sencilla de eva...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Número de catálogo </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15, sin rojo fenol </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, por Tecnologías de la Vida </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO, por Tecnologías de la Vida </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO, por Tecnologías de la Vida </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

Förster transferencia de energía por resonancia (FRET) basado en una prensa permite la evaluación de la quinasa endógena y las actividades de la fosfatasa en las células vivas. Estas sondas consisten normalmente en las variantes de la PPC y YFP, intervenido por una secuencia phosphorylatable y un dominio de unión a fosfato. Tras la fosforilación, la conformación de la sonda cambios, que se traduce en un cambio de la distancia y orientación entre la PPC y YFP, dando lugar a un cambio en la eficiencia de FRET (Figura 1). Varias sondas han sido publicados en la última década, el seguimiento del balance de la actividad de múltiples quinasas y fosfatasas, incluyendo reporteros de la PKA 2, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, Cdk 18, Aurora B 9 y Plk1 9 . Dada la estructura modular, sondas adicionales es probable que surjan en el futuro cerca de 10. Progresión del ciclo celular se ve afectada por el estrés signaling vías 11. Cabe destacar que el ciclo celular está regulado de manera diferente durante imperturbable crecimiento en comparación con cuando las células se están recuperando del estrés 12. Time-lapse de imágenes de células a través del ciclo celular por lo que requiere especial precaución. Esto se convierte en un problema particularmente cuando se emplean imágenes radiométrica, ya que dos imágenes con una elevada relación señal ruido están obligados a interpretar correctamente los resultados. Radiométrica de imágenes de FRET los cambios dependiente del ciclo celular en las actividades de quinasa y fosfatasa ha sido predominantemente restringida a sub-secciones del ciclo celular 8,9,13,14. En este caso, hablamos de un método para supervisar FRET basado en sondas utilizando imágenes radiométrica todo el ciclo de la célula humana. El método se basa en un equipo que está disponible para muchos investigadores en ciencias de la vida y no requiere conocimientos técnicos de la microscopía y procesamiento de imágenes.

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Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

FRET basada en los periodistas están cada vez más utilizado para monitorear las actividades de quinasa y fosfatasa en las células vivas. Aquí se describe un método sobre el uso de FRET basada en la prensa para evaluar el ciclo celular dependiente de los cambios en la fosforilación de destino.

Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

La extracción de sangre de las ratas a través de la vena safena y por punción cardiaca

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Investigación

Biología

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Sincronización de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para la Investigación del Ciclo Celular Bacteriana

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Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...