Name: monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET at JoVE.com

Författarna stöds av det svenska Vetenskapsrådet, svenska Stiftelsen för strategisk forskning, svenska Cancerfonden, Svensk barncancer samhället, Åke Wibergs stiftelse och Jeanssons stiftelse.

1. Introduktion sonden till celler <ol><li> Co-transfektera celler med en FRET-baserad sond och en plasmid som ger resistens. Välj ett transfektion metod som är effektiv i din cell-typ av intresse. För U2OS celler standard kalciumfosfat transfektion metoder ger tillräckligt resultat 15. </li><li> Markera celler i lämpliga antibiotika i minst sju dagar. Detta berikar mängd celler som uttrycker sonden och begränsar mängden celler med giftiga uttryck nivåer eller nivåer uttryck som allvarligt påverk...

<ol>
	<li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+microscopy+in+2010:+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth.">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li><li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B/Akt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter.">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li><li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase.">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li><li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter.">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li><li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity.">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li><li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis.">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li><li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient.">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li><li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters.">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 .</li><li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The cell cycle : principles of control. , (2007).</li><li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+decision+to+enter+mitosis:+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network.">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li><li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery.">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li><li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA.">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li><li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+free,+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis.">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li></ol>

Övervakning FRET hela cellcykeln kräver överväganden som är mindre viktiga vid bedömningen av kortsiktiga reaktioner på yttre stimuli. För det första är cellcykelreglering lätt störd av stress signalering, som kräver att fototoxicitet hålls till ett minimum. För det andra kan alla reportrar påverka potentiellt cellulära processer genom att titrera ut kinaser, fosfataser eller domäner interaktion. Det förmodligen enklaste sättet att bedöma om de experimentella förutsättningarna är tillräckliga ä...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Katalognummer </td><td> Företag </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15, ingen fenolrött </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO genom Life-teknik </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31.966 </td><td> GIBCO genom Life-teknik </td></tr><tr><td> Fostrets bovint serum (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Penicillin-streptomycin </td><td> SV30010 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14.287 </td><td> GIBCO genom Life-teknik </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase and phosphatase activities through the cell cycle by ratiometric fret

Förster resonans energy transfer (FRET)-baserade reportrar 1 medger en bedömning av endogena kinas och aktiviteter fosfatas i levande celler. Sådana givare består i regel av varianter av GFP och YFP ingrep genom en phosphorylatable sekvens och en fosfor-bindande domän. Vid fosforylering, sonden förändringar konformation, vilket resulterar i en förändring av avståndet eller orienteringen mellan fiskeripolitiken och YFP, vilket leder till en förändring i FRET effektivitet (Fig. 1). Flera givare har publicerats under det senaste decenniet, övervaka verksamheten balans av flera kinaser och fosfataser, däribland reportrar på PKA 2, 3 PKB, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 och Plk1 9 . Med tanke på den modulära design, fler sonder kommer sannolikt att dyka upp inom en snar framtid 10. Progression genom cellcykeln påverkas av stress signaling vägar 11. Noterbart är cellcykeln regleras annorlunda under oberörd tillväxt jämfört med när celler återhämtar sig från stress 12. Time-lapse avbildning av celler genom cellcykeln kräver därför särskild försiktighet. Detta blir ett problem särskilt vid anställning ratiometrisk bildbehandling, eftersom två bilder med en hög signal-brus-förhållande som krävs för att korrekt tolka resultaten. Ratiometrisk FRET avbildning av beroende cellcykelns förändringar i kinas och fosfatas verksamheten huvudsakligen har begränsats till underavdelningar av cellcykeln 8,9,13,14. Här diskuterar vi en metod för att övervaka FRET-baserade prober med ratiometrisk avbildning hela den mänskliga cellcykeln. Metoden bygger på utrustning som är tillgänglig för många forskare inom biovetenskap och inte kräver expertkunskaper om mikroskopi eller bildbehandling.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET at JoVE.com

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

FRET-baserade journalister alltmer används för att övervaka kinas och fosfatas aktiviteter i levande celler. Här beskriver vi en metod på hur man använder FRET-baserade reportrar att bedöma cellcykeln-beroende förändringar i målet fosforylering.

Övervakning Kinase och fosfatas verksamhet genom cellcykeln genom Propportionell FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Research

JoVE Journal

Biology

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Dra blod från råttor genom ytlig ven och från hjärtat

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analys av cellcykeln Position i däggdjursceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studera DNA Looping med enda molekyl FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synkronisering av<em&gt; Caulobacter Crescentus</em&gt; För utredning av bakteriecellcykeln

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Temporal Spårning av cellcykelprogression med användning av flödescytometri utan behov av synkronisering

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimentella metoder för att studera mitokondrie Lokalisering och funktion av en kärnteknisk Cell Cycle kinas, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analys: Icke-invasiv Adrenal Övervakning av equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G-protein-selektiva GPCR konforma mäts med hjälp av FRET sensorer i en levande cell Suspension Fluorometer analys

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Kombinera mitotiska Cell synkronisering och hög upplösning konfokalmikroskopi att studera rollen av multifunktionella cellcykelns proteiner under Mitos

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...