Name: fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00
Duration: 14 min 18 s
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Wir danken Dr. Noah Weisleder zum Lesen und Editieren von diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien UMDNJ Stiftung 62-09 bis ZP, American Heart Association SDG2630086 zu XZ, 0535555N zu MB, und National Institutes of Health RC2AR058962-01 bis MB unterstützt.

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	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Obwohl die Anregungswellenlängen für Ca 2 +-Bindung und Ca 2 +-freien Fura-2 340 nm und 380 nm sind jeweils das beste Verhältnis Dynamikbereich von Fura-2 für Ca 2 +-Konzentration Messung kann bei anderen Wellenlängen bei einer bestimmten Mikroskop-System. Solche Verschiebungen in der Wellenlänge sind in der Regel aufgrund von Änderungen in dem optischen Pfad mit der Zugabe von verschiedenen optischen Komponenten. In dieser Studie wurden die Anregungswellenlängen für Fura-2 als 350 nm und 390 nm zur Spektralanalyse von Fura-2 Fluoreszenz bestimmt. Die intrazellulären Ca 2 +-Ebene im Zytosol resultiert aus einem Gleichgewicht aus mehreren Quellen, einschließlich intrazellulärer Ca 2 +-Freisetzung, extrazellulären Ca 2 +-Eintrag, sowie Ca 2 +-Ausschluss-Mechanismus an der ER und Plasmamembran. Um die unidirektionale SOC-vermittelte Ca 2 +-Einstrom aus intrazellulären Ca 2 +-Freisetzung und Ca 2 + extr isolierenusion, kann die Mn 2 + Abschrecken des Tests verwendet werden. Mn 2 + ist bekannt, können in die Zellen über SOCE Permeat aber undurchlässig für Oberflächenmembran Extrusion oder ER Aufnahme von Ca 2 +-Pumpen. Daher stellt Fluoreszenzlöschung eine Messung der unidirektionalen Mn 2 +-Fluss in die Zellen, die den Grad der Aktivierung des SOCE schätzt. Mn 2 + Abschrecken Test wird bei der isosbestischen Punkt durchgeführt, an solchen Wellenlänge Fura-2-Fluoreszenzintensität ist unabhängig von Ca 2 +-Konzentration. Die isosbestischen Punkt für jedes System sollte durch Scannen Spektrum bestimmt werden. Alternativ kann Mn 2 + Abschrecken durch angepasste Fluoreszenz bei zwei beliebigen Wellenlängen so dass der endgültige Wert unabhängig von Ca 2 +-Konzentration 13 aufgezeichnet werden. Um die räumlichen und zeitlichen Informationen der Tätigkeit der SOCE in der Skelettmuskulatur zu gewinnen, verwendeten wir eine Dual-Farbstoff-Methode, die gleichzeitige MeasureMe erlaubtnt von SOCE Aktivität und SR Ca 2 +-Gehalt in enthäuteten erwachsener Säugetiere EDL Muskelfasern. Die Korrelation zwischen den Veränderungen im SR Ca 2 +-Gehalt und SOCE Aktivität kann aufgetragen, um die Schwelle und Empfindlichkeit der SOCE Aktivierung zu einer Erschöpfung des SR Ca 2 +-Lagerung hinzuweisen. Der TT-loading Lösung ist optimiert, um zusätzlich laden die T-Tubuli mit Ca 2 + und für die Grundierung der T-Tubuli und der SR-loading-Lösung wurde entwickelt, um maximale SR Ca 2 +-Beladung zu fördern und zusätzlich laden die T-Tubuli mit ~ 500 uM Ca 2 +. FCCP befindet sich im TT / SR-loading-Lösung und der SR-abbauenden Lösung, um die Effekte aus den Mitochondrien eliminieren enthalten.

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte: <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham &#39;s F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Dish </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, Dichtung eng, vor Licht geschützt, in DMSO gelöst </td></tr><tr><td> Fluo-5N Uhr </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, Dichtung dicht, von l geschütztight </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, Dichtung eng, vor Licht geschützt </td></tr><tr><td> Quarzküvette </td><td> Starna Cells </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase Typ I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Ausstattung: <ol><li> Ein Spektrofluorometer (Photon Technology International, New Jersey): Xenon-Bogenlampe, computergesteuerten High-Speed-Random-Access-Monochromator, Küvetten-basierte Emissionsmonochromator, Nikon TE-200 invertierte Fluoreszenz-MikroskopE, S Fluor 40x/1.30 Öl-Objektiv, PMT-Detektoren. </li><li> Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (BioRad Radiance2100): 453/477/488/514 Argonlaser, HeNe-Laser 543nm, Nikon TE2000 inversen Mikroskop, 60x Objektiv (NA 1.4, Öl). </li><li> Ein Stereomikroskop mit einer Vergrößerungsleistung&gt; 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo). </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

Shop betrieben Ca 2 +-Eintrag (SOCE), früher nannte kapazitiven Ca 2 +-Eintrag, ist ein stark regulierter Mechanismus zum Einstrom von extrazellulären Ca 2 + in Zellen mit abgereichertem Endoplasmatischen Retikulum (ER) oder sarkoplasmatischen Retikulum (SR) Ca 2 + wieder aufzufüllen 1,2. Da Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges second messenger, ist es nicht überraschend zu sehen, dass SOCE spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Proliferation, Apoptose, Gen-Transkription und Motilität. Aufgrund ihrer weiten Verbreitung in nahezu allen Zelltypen, einschließlich Epithelzellen und Skelettmuskulatur, hat dieser Signalweg großes Interesse 3,4 erhielt. Allerdings sind die Heterogenität der SOCE Eigenschaften in verschiedenen Zelltypen und die physiologische Funktion noch nicht klar, 5-7. Die funktionellen Eigenschaften von Kanal SOCE kann durch Patch-Clamp-Studien enthüllt werden, während ein großer Teil der Kenntnisse über this-Mechanismus wurde durch Fluoreszenz-basierten intrazellulärer Ca 2 +-Messungen wegen seiner Bequemlichkeit und Machbarkeit für das Hochdurchsatz-Screening gewonnen werden. Das Ziel dieses Berichtes ist es, ein paar Fluoreszenz-basierten Methoden zusammenfassen, um die Aktivierung von SOCE in Monolayer-Zellen, suspendierten Zellen und Muskelfasern 5,8-10 messen. Die am häufigsten von dieser Fluoreszenz-Methoden verwendet, ist die direkte Überwachung der Dynamik der intrazellulären Ca 2 + aus dem Verhältnis von F und F 340 nm 380 nm (510 nm für die Emissions-Wellenlänge) des ratiometrische Ca 2 +-Indikator Fura-2. Um die Aktivität von unidirektionalen SOCE von intrazellulärer Ca 2 +-Freisetzung und Ca 2 +-Extrusion zu isolieren, wird ein Mn 2 +-Quenching-Assay häufig verwendet. Mn 2 + ist bekannt, können in die Zellen über SOCE Permeat während es undurchlässig für die Oberflächenmembran Extrusionsverfahren oder ER Aufnahme von Ca 2 + Pumpen aufgrund seiner sehr hohen Affinität nämlichh Fura-2. Als Ergebnis stellt das Abschrecken Fura-2 Fluoreszenz durch den Eintrag von extrazellulärem Mn 2 + in den Zellen induziert eine Messung der Aktivität von SOCE 9. Quotientenmeßschaltung und die Mn +2 Abschrecken Assays können auf einer Küvette-basierten Spektrofluorometer in einer Zellpopulation Modus oder in einem Mikroskop-System, um einzelne Zellen zu visualisieren durchgeführt werden. Der Vorteil einer einzigen Zelle Messungen ist, dass einzelne Zellen unterzogen, um Gen-Manipulationen ausgewählt werden unter Verwendung von GFP oder RFP-Reporter, so dass Studien in genetisch modifizierten oder mutierten Zellen werden. Diese räumliche Merkmale SOCE strukturell spezialisierten Skelettmuskel in Haut Muskelfasern durch gleichzeitiges Überwachen der Fluoreszenz von zwei geringe Affinität Ca 2 +-Indikatoren erreicht werden und gezielt auf die Abteile der Muskelfaser, wie zB Fluo-5N in der SR und Rhod- 5N im transversalen Tubuli 9,11,12.

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Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Das Ausmaß der store-betriebenen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Eintrag (SOCE) kann überwacht werden, unter Verwendung von fluoreszierenden Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikatoren. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Löschung solcher Indikatoren Assays SOCE in kultivierten Zellen und Fasern der Skelettmuskulatur. Eine Technik, so dass räumliche und zeitliche Auflösung von SOCE durch konfokale Bildgebung von mechanisch gehäutet Muskelfasern wird ebenfalls beschrieben.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Forschung

Biologie

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Live Cell Imaging von Pilzzellen Modi des Eintrags und subzelluläre Lokalisation der antimykotische Pflanze Defensine zu untersuchen

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...