Name: fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

אנו מודים ד&quot;ר נח Weisleder לקריאה ועריכה של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר UMDNJ קרן 62-09 כדי זף, American Heart Association SDG2630086 כדי XZ, 0535555N כדי MB, ואת המכונים הלאומיים לבריאות RC2AR058962-01 ל MB.

<ol>
	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29.">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li><li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+in+skeletal+muscle.">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells.">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li><li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+intracellular+Ca2++by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor.">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li><li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+store-operated+Ca2++entry+and+altered+Ca2++release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes.">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li><li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אף על פי אורכי גל עירור של Ca 2 +, מחייב Ca 2 + חינם פורעה-2 הם 340 ננומטר ו -380 ננומטר, בהתאמה, טווח דינמי היחס הטוב ביותר של פורעה-2 עבור Ca 2 + מדידת ריכוז עלולה להתרחש באורכי גל אחרים מסוים מיקרוסקופ המערכת. שינויים כאלה הם בדרך כלל באורך גל עקב שינוי מסלול אופטי עם תוספת של רכיבים אופטיים שונים. במחקר זה, אורכי גל של עירור עבור פורעה-2 היו נחושים כמו 350 ננומטר ו -390 ננומטר על ידי ביצוע ניתוח ספקטרלי של הקרינה פורעה-2. תאיים Ca 2 + רמת בתוצאות cytosol ממאזן של מספר מקורות, כולל תאיים Ca 2 + שחרור, תאי Ca 2 + כניסה, כמו גם Ca 2 + מנגנון הרחקה על ממברנת ER ו פלזמה. לבודד חד כיווני SOC בתיווך Ca 2 + גל מ תאיים Ca 2 + שחרור Ca 2 + extrusion, Mn 2 + assay מרווה ניתן להשתמש. Mn 2 + ידוע להיות מסוגל לחדור לתוך התאים באמצעות SOCE אבל הוא אטום שחול פני הממברנה או ספיגת ER ידי Ca 2 + משאבות. לכן, מרווה הקרינה מהווה מדידה של Mn 2 + חד כיווני השטף לתאים האומד את מידת הפעלת SOCE. Mn 2 + assay מרווה מתבצע בשלב isosbestic, באורך גל כזה פורעה-2 עוצמת הקרינה היא עצמאית של Ca 2 + ריכוז. נקודת isosbestic עבור כל מערכת צריך להיקבע על ידי סריקת הספקטרום. לחלופין, Mn 2 + מרווה ניתן להקליט על ידי הקרינה המתואם על כל שני אורכי הגל באופן כזה את הערך הסופי אינו תלוי Ca 2 + ריכוז 13. כדי לקבל את המידע במרחב ובזמן הפעילות של SOCE על שרירי השלד, אנחנו עובדים בשיטה כפול צבע, המאפשר measureme בו זמניתNT הפעילות SOCE ו-SR Ca 2 + תוכן עור יונקים בוגרים סיבי שריר אדי. מתאם בין שינויים SR Ca 2 + פעילות התוכן SOCE ניתן להתוות כדי לציין את סף הרגישות של הפעלת SOCE דלדול של Ca SR 2 + אחסון. פתרון TT-loading מותאם בנוסף לטעון את T-tubules עם Ca 2 + ועל תחול של T-tubules והפתרון SR-loading נועד לקדם את מרבית SR Ca 2 + ו טוען בנוסף לטעון את T-tubules עם ~~~HEAD=NNS 500 מיקרומטר Ca 2 +. FCCP נכלל פתרון TT / SR-loading והפתרון SR-depleting לחסל את ההשפעות של המיטוכונדריה.

טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> חם של F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> תחתית זכוכית מהודרת </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> פורעה-2 בבוקר </td><td> Invitrogen (בדיקות מולקולריות) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, חותם חזק, מוגן מפני אור, התמוססו DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N הרכב </td><td> Invitrogen (בדיקות מולקולריות) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, חותם חזק, מפני שאניight </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (בדיקות מולקולריות) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, חותם חזק, מוגן מפני אור </td></tr><tr><td> קוורץ קובט </td><td> Starna תאים </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-בנזיל-P-טולואן sulphonamide (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase סוג אני </td><td> סיגמא </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> ציוד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spectrofluorometer (פוטון הטכנולוגית הבינלאומית, NJ): מנורת קסנון קשת, מבוקרת מחשב מהיר monochromator גישה אקראית, קובט מבוסס פליטת monochromator, ניקון TE-200 הקרינה הפוך microscopדואר, S המטרה 40x/1.30 פלואוריד שמן, גלאי PMT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקת לייזר מיקרוסקופ Confocal (BioRad Radiance2100): ארגון לייזר 453/477/488/514, HeNe לייזר 543nm, מיקרוסקופ TE2000 Nikon הפוכה, המטרה 60x (NA 1.4, שמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטראו עם כוח הגדלה&gt; 100 (STEMI SV11 Zeiss Apo). </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

החנות פעלה Ca 2 + כניסה (SOCE), כינה מוקדם יותר קיבוליים Ca 2 + כניסה, הוא מנגנון פיקוח הדוק על זרם של Ca 2 + תאי אל תוך התאים לחדש reticulum endoplasmic מדולדל (ER) או reticulum sarcoplasmic (SR) ע&quot;א + 2 חנויות 1,2. מאז Ca 2 + 2 הוא שליח בכל מקום, אין זה מפתיע לראות כי SOCE משחק תפקידים חשובים במגוון רחב של תהליכים תאיים, לרבות הפצת שעתוק הגן אפופטוזיס, ואת תנועתיות. בשל התרחשות רחב כמעט בכל סוגי תאים, כולל תאים אפיתל ועל שרירי השלד, מסלול זה זכה עניין רב 3,4. עם זאת, ההטרוגניות של מאפיינים SOCE של סוגי תאים שונים הפונקציה הפיזיולוגית עדיין לא ברור 5-7. המאפיינים ערוץ תפקודיות של SOCE יכול להתגלות על ידי תיקון, מהדק מחקרים, בעוד גוף גדול של ידע על תימסלול זה כבר שנרכשו על ידי הקרינה מבוססי תאיים ע&quot;א 2 + מדידות בגלל הנוחות שלה היתכנות לסינון תפוקה גבוהה. מטרת דו&quot;ח זה היא לסכם כמה הקרינה המבוססים על שיטות למדוד את הפעלת SOCE בתאים monolayer, תאים על תנאי סיבי שריר 5,8-10. הנפוץ ביותר של שיטות אלו הקרינה היא ישירות לעקוב אחר הדינמיקה של Ca 2 + תאיים באמצעות היחס בין F 340nm ו 380nm פריץ (510 ננומטר עבור אורך גל הפליטה) של Ca 2 + ratiometric מדד פורעה-2. כדי לבודד את הפעילות של SOCE חד כיווני בין תאיים Ca 2 + שחרור Ca 2 + שחול, Mn 2 + assay מרווה נעשה שימוש תכוף. Mn 2 + ידוע להיות מסוגל לחדור לתוך התאים באמצעות SOCE כאשר הוא אטום על פני הממברנה תהליכים שחול או ספיגת ER ידי Ca 2 + משאבות בשל השנינות שלה זיקה גבוהה מאודH-2 פורעה. כתוצאה מכך, מרווה של הקרינה-2 פורעה הנגרם על ידי כניסת תאי Mn 2 + לתוך התאים מהווה מדידה של פעילות SOCE 9. מדידת Ratiometric ואת +2 מבחני MN מרווה יכול להתבצע על spectrofluorometer קובט מבוסס במצב האוכלוסייה תא או מערכת המיקרוסקופ מבוסס לדמיין תאים בודדים. היתרון של מדידות תא בודד הוא כי תאים בודדים נתון מניפולציות גנטיות ניתן לבחור בעזרת ה-GFP או כתבים RFP, המאפשר לימודי תאים מהונדסים גנטית או מוטציה. המאפיינים של spatiotemporal SOCE בשריר השלד מתמחה מבנית ניתן להשיג סיבי שריר עור בו זמנית על ידי ניטור הקרינה של 2 נמוך זיקה Ca 2 + אינדיקטורים ממוקדות תאים ספציפיים של סיבי השריר, כגון Fluo-5N ב SR ו Rhod למוצרי 5N ב tubules רוחבי 9,11,12.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

היקף חנות המופעל Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; כניסה (SOCE) ניתן לנטר באמצעות ניאון Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אינדיקטורים. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; מרווה של SOCE מבחני אינדיקטורים כגון בתאים בתרבית לבין סיבי שריר השלד. הטכניקה מאפשרת רזולוציה במרחב ובזמן של SOCE ידי הדמיה confocal של סיבי שריר פשוטי עור מכני מתואר גם.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...