Name: fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00
Duration: 14 min 18 s
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私たちは、読書と、この原稿を編集するために博士ノアWeislederに感謝します。この作品は、MBに0535555N ZP、XZに米国心臓協会SDG2630086、および国立衛生研究所RC2AR058962-01 MBまでに研究費補助金UMDNJ財団62から09でサポートされていました。

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	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29.">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li><li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+in+skeletal+muscle.">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells.">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li><li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+intracellular+Ca2++by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor.">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li><li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+store-operated+Ca2++entry+and+altered+Ca2++release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes.">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li><li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

Ca 2 +結合およびCa 2 +フリーフラ-2の励起波長は、それぞれ340nmおよび380nmであるが、Caの2のフラ-2の最高の比ダイナミックレンジ+濃度測定は、特に、他の波長で発生する可能性があります顕微鏡システム。波長のようなシフトは、通常、様々な光学部品を添加した光路の変化によるものである。本研究では、フラ-2の励起波長は、フラ-2蛍光のスペクトル解析を行うことにより、350 nmと390 nmで測定した。 を含むいくつかのソースのバランスから、細胞質ゾルの結果細胞内Ca 2 +レベル、細胞内Ca 2 +放出は、細胞外Ca 2 +のエントリと同様に、小胞体と細胞膜でのCa 2 +排除機構。細胞内Ca 2 +放出とCa 2 + EXTRから一方向のSOC-介在Ca 2 +流入を単離するために、usionは、Mn 2 +が消光アッセイを使用することができます。のMn 2 +は SOCEを介して細胞に浸透することができることが知られているが、表面膜の押し出しまたはCa 2によってERの取り込み+ポンプへの浸透です。したがって、蛍光消光は、単方向のMn 2 + SOCEの活性化の度合いを推定する細胞内へのフラックスの測定を表しています。のMn 2 +クエンチアッセイは、このような波長で、等吸収点で行わフラ-2蛍光強度がCa 2 +濃度とは無関係です。されてい各システムの等吸収点は、スペクトラム·スキャンによって決定されるべきである。また、Mn 2 +の消光は、最終的な値は、Ca 2 +濃度の13の独立しているような方法で、任意の2つの波長で調整された蛍光によって記録することができます。 骨格筋におけるSOCEの活動の空間的および時間的情報を得るために、我々は同時measuremeを可能にするデュアル色素法を採用SOCE活動のNTおよびSRのCa 2 +肌の大人の哺乳類のEDL筋線維内のコンテンツ。 SRのCa 2の変化の間に相関が+コンテンツとSOCE活動は、SRのCa 2 +貯蔵の枯渇にSOCE活性化のしきい値と感度を示すためにプロットすることができます。 TT-ローディング溶液は、さらにカルシウム2とT-細管をロードするために最適化されている+とT-細管とSR-ローディング溶液のプライミングのために最大限のSRのCa 2 +ローディングを促進し、さらにT-細管をロードするように設計されています〜500μMのCa 2 +。 FCCPは、TT / SR-ローディング溶液とミトコンドリアからの影響を排除するためにSR-オゾンソリューションに含まれています。

特定の試薬や機器の表： <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>メディアテック</td><td> 10から040-CV </td><td></td></tr><tr><td>ハムのF-12 </td><td>メディアテック</td><td> 10から080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>メディアテック</td><td> 10から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>ガラスボトムディッシュ</td><td>マテック</td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> AMフラ-2 </td><td> Invitrogen社（Molecular Probes）を</td><td> F1221 </td><td> -20°C、DMSOに溶解し、光から保護シールタイト、 </td></tr><tr><td>蛍光-5N AM </td><td> Invitrogen社（Molecular Probes）を</td><td> F14204 </td><td> -20°C、密封、Lから保護IGHT </td></tr><tr><td> rhodo-の異形5N </td><td> Invitrogen社（Molecular Probes）を</td><td> R14207 </td><td> -20°C、シールタイト、光から保護</td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td> Starna細胞</td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td>タプシガルギン</td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Aminoethoxydiphenylborane（2-APB） </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-ベンジル-p-トルエンスルホンアミド（BTS） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプI </td><td>シグマ</td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table>設備： <ol><li>分光蛍光光度計（フォトンテクノロジーインターナショナル、NJ）：キセノンアークランプ、コンピュータ制御の高速ランダム·アクセス·モノクロ、キュベットベースの発光分光、ニコンTE-200倒立蛍光microscopE、S弗素40x/1.30油浸対物、PMT検出器。 </li><li>アルゴンレーザー453/477/488/514、HeNeレーザー543nm、ニコン倒立顕微鏡TE2000、60X対物レンズ（NA 1.4、油）：レーザー共焦点顕微鏡（BioRad社Radiance210​​0）をスキャンしています。 </li><li>倍率の実体顕微鏡&gt; 100（ツァイスSTEMI SV11 APO）。 </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

店は以前の容量性Ca 2 +のエントリと呼ばれる、Ca 2 +のエントリ（SOCE）を運営し、+枯渇小胞体（ER）や筋小胞体（SR）のCa 2 +ストアを補充する細胞に細胞外Ca 2 +の流入のために厳密に制御メカニズムです。 1,2。のCa 2 +ユビキタスセカンドメッセンジャーであるので、SOCEが増殖、アポトーシス、遺伝子の転写と運動性を含む細胞プロセスの様々な重要な役割を果たしているのを見て驚くことではありません。上皮細胞と骨格筋を含むほぼすべての細胞型で広い発生のため、この経路は、大きな関心3,4を受けています 。ただし、異なる細胞型と生理機能のSOCE特性の不均一性は、まだ5-7クリアされていません。 SOCEの機能チャネルのプロパティは、THIに関する知識の大きな体に対し、パッチクランプ法の研究によって明らかにすることができるの経路があるため、ハイスループットスクリーニングのため、その利便性と実現可能性の蛍光ベースの細胞内Ca 2 +測定によって得られている。このレポートの目的は、単層細胞、浮遊細胞や筋線維5,8-10でSOCEの活性化を測定するためにいくつかの蛍光ベースの方法を要約することである。最も一般的にこれらの蛍光法の使用は、直接細胞内Ca 2 +の動態を監視するために+ F 340nm、レシオメトリックのCa 2 +インジケーターフラ-2のF 波長380nm（発光波長510 nm）の比を使用しています。細胞内Ca 2から一方向SOCEの活性を分離するには+の放出とCa 2 +放出は、Mn 2 +クエンチアッセイが頻繁に使用されます。それは非常に高い親和性ウィットのために+ポンプ表面膜の押出プロセスまたはCa 2によってERの取り込みに不浸透性のある間のMn 2 +は SOCEを介して細胞に浸透することができることが知られているHフラ-2。その結果、細胞内に細胞外のMn 2 +のエントリによって誘発されるフラ-2蛍光の消光がSOCE 9の活性の測定を表しています。レシオメトリック測定とMn 2消光アッセイは、単一細胞を可視化する細胞集団モードまたは顕微鏡ベースのシステムでキュベットベースの蛍光光度計で実行することができます。単一細胞の測定の利点は、遺伝子操作を受け、個々の細胞は、遺伝子組み換えや変異細胞の研究をできるように、GFPまたはRFPレポーターを使用して選択することができることである。構造的に特殊な骨格筋でSOCEの時空間特性は、同時に二つの低親和性Ca 2 +の蛍光を監視することによって、肌の筋線維で達成することができるSRと、このようなにみたFluo-5Nとして筋線維の特定のコンパートメントを対象とした+の指標rhodo-の異形横細管9,11,12で5N。

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Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

ストア作動性Caの範囲<sup&gt; 2 +</sup&gt;エントリ（SOCE）は、蛍光Caを使用して監視することができます<sup&gt; 2 +</sup&gt;指標。 Mnは<sup&gt; 2 +</sup培養細胞や骨格筋線維のような指標アッセイSOCEの&gt;消光。機械的に皮筋線維の共焦点イメージングによるSOCEの空間分解能と時間分解能を可能にする技術も記載されています。

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

骨格筋からのミトコンドリア単離

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

骨格筋からの前駆体の精製

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

エントリのモードと抗真菌植物のディフェンシンの細胞内局在を検討する真菌細胞の生細胞イメージング

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...