Name: fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00
Duration: 14 min 18 s
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Agradecemos ao Dr. Noé Weisleder para leitura e edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Research Grants UMDNJ Fundação 62-09 de ZP, American Heart Association SDG2630086 a XZ, 0535555N a MB, e National Institutes of Health RC2AR058962-01 a MB.

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	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. 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J. 90, 4418-4427 (2006).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li><li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Embora os comprimentos de onda de excitação para Ca 2 +-binding e Ca 2 + livre Fura-2 são 340 nm e 380 nm, respectivamente, a gama dinâmica melhor proporção de Fura-2 para o Ca 2 + medição da concentração pode ocorrer em outros comprimentos de onda em particular um sistema de microscópio. Tais mudanças no comprimento de onda são geralmente devido a alterações no percurso óptico com a adição de vários componentes ópticos. Neste estudo, os comprimentos de onda de excitação para Fura-2 foram determinados como a 350 nm e 390 nm através da realização de análise espectral de Fura-2 fluorescência. A intracelular de Ca 2 + nível nos resultados do citosol a partir de uma balança de várias fontes, incluindo intracelular de Ca 2 + libertação, extracelular Ca 2 + entrada, bem como Ca 2 + mecanismo de exclusão na membrana ER e de plasma. Para isolar o unidireccional SOC mediada influxo de Ca 2 + intracelular de Ca 2 + libertação e Ca 2 + extrusion, o Mn 2 ensaio de têmpera + pode ser usado. Mn 2 + é conhecido por ser capaz de penetrar nas células por meio de SOCE mas é impermeável a extrusão superfície da membrana ou absorção ER por Ca 2 + bombas. Portanto, extinção de fluorescência representa uma medição de Mn unidireccional 2 + fluxo em células que estima o grau de activação de SOCE. Mn 2 + ensaio de têmpera é realizada no ponto isosbestic, no comprimento de onda, tais Fura-2 intensidade de fluorescência é independente de Ca 2 + concentração. O ponto de isosbestic para cada sistema deve ser determinada por varrimento do espectro. Alternativamente, Mn 2 têmpera + pode ser gravado por fluorescência corrigido em qualquer dois comprimentos de onda, de tal maneira que o valor final é independente da concentração de Ca 2 + 13. Para obter a informação espacial e temporal da atividade de SOCE nos músculos esqueléticos, que utilizou o método duplo-dye, que permite MeasureMe simultâneant de SOCE atividade e Ca 2 + SR conteúdo em pele de mamíferos adultos fibras musculares EDL. A correlação entre as mudanças na SR Ca 2 + atividade de conteúdo e SOCE podem ser plotados para indicar o limite de sensibilidade e de ativação SOCE ao esgotamento do Ca SR 2 + armazenamento. A solução TT-carregamento é otimizado para carregar adicionalmente túbulos T com Ca 2 + e para o condicionamento de túbulos T ea solução SR-carregamento foi projetado para promover a máxima SR Ca 2 + e de carga para carregar adicionalmente túbulos T com ~ 500 uM Ca 2 +. FCCP está incluído na solução de TT / SR-carregamento ea solução SR-empobrecimento de eliminar os efeitos da mitocôndria.

Tabela dos reagentes e equipamentos específicos: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Prato fundo de vidro </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 PM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, a vedação estanque, protegido da luz, dissolvido em DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, a vedação estanque, protegido de light </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, a vedação estanque, protegido da luz </td></tr><tr><td> Quartz Cuvette </td><td> Células Starna </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> tapsigargina </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-benzil-p-tolueno sulfonamida (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Equipamentos: <ol><li> Um espectrofluorímetro (Photon Technology International, NJ): xenon lâmpada de arco, controlada por computador de alta velocidade de acesso aleatório monocromador, célula-base de emissão monocromador, Nikon TE-200 fluorescência invertido Microscope, S Fluor objetivo óleo 40x/1.30, detectores PMT. </li><li> Laser Scanning microscópio confocal (BioRad Radiance2100): laser de argônio 453/477/488/514, laser HeNe 543nm, Nikon microscópio invertido TE2000, 60X objetivo (NA 1.4, óleo). </li><li> A estereomicroscópio com um poder de ampliação&gt; 100 (Zeiss Apo Stemi SV11). </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

Loja operado Ca 2 + entrada (SOCE), anteriormente denominado capacitiva Ca 2 + entrada, é um mecanismo altamente regulado para influxo de Ca 2 + extracelular em células para repor empobrecido retículo endoplasmático (ER) ou retículo sarcoplasmático (SR) de Ca 2 + lojas 1,2. Uma vez que o Ca 2 + é um mensageiro ubíquo em segundo lugar, não é surpreendente verificar que SOCE desempenha papéis importantes numa variedade de processos celulares, incluindo transcrição proliferação, gene apoptose, e motilidade. Devido à sua ampla ocorrência em quase todos os tipos de células, incluindo células epiteliais e os músculos esqueléticos, esta via tem recebido grande interesse 3,4. No entanto, a heterogeneidade das características SOCE em diferentes tipos de células e da função fisiológica ainda não são claros 5-7. As propriedades funcionais do canal SOCE pode ser revelada por patch-clamp estudos, enquanto que uma grande corpo de conhecimento sobre thivia de s foi adquirida por fluorescência baseados intracelulares de Ca 2 + medições por causa de sua conveniência e viabilidade de high-throughput screening. O objetivo deste relatório é resumir alguns fluorescência baseados em métodos para medir a ativação de SOCE em monocamada de células, as células em suspensão e fibras musculares 5,8-10. Os mais comumente usados ​​os métodos de fluorescência é monitorar diretamente a dinâmica de Ca 2 + intracelular função da relação entre F e F 340nm 380nm (510 nm para a emissão de comprimento de onda) do Ca 2 + raciométrica indicador Fura-2. Para isolar a actividade de SOCE unidireccional a partir intracelular de Ca 2 + libertação e Ca 2 + extrusão, um Mn 2 ensaio de têmpera + é frequentemente utilizado. Mn 2 + é conhecido por ser capaz de penetrar nas células por meio de SOCE ao mesmo tempo que é impermeável à superfície da membrana processos de extrusão ou a absorção de ER por Ca 2 + bombas, devido à sua elevada afinidade with Fura-2. Como resultado, a supressão de Fura-2 fluorescência induzida pela entrada de Mn 2 + extracelular para dentro das células representa uma medição da actividade de SOCE 9. Medição raciométrica e os ensaios de Mn +2 têmpera pode ser realizada em um espectrofluorímetro cuvete baseada no modo de uma população de células ou em um sistema de microscópio-Based para visualizar células individuais. A vantagem de medições de célula única é que as células individuais submetidos a manipulações genéticas podem ser seleccionadas utilizando GFP ou repórteres RFP, permitindo que os estudos em células geneticamente modificadas ou mutantes. As características espaço-temporais de SOCE em estruturalmente especializado músculo esquelético pode ser conseguido nas fibras musculares pele por simultaneamente o controlo da fluorescência de duas baixa afinidade de Ca 2 + indicadores que permitam compartimentos específicos da fibra muscular, tais como Fluo-5N na SR e Rhod de 5N nos túbulos transversal 9,11,12.

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Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

A extensão da loja operado Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Entrada (SOCE) pode ser monitorizado utilizando fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicadores. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Extinção de tais indicadores SOCE ensaios em cultura de células e fibras musculares esqueléticas. Uma técnica que permita a resolução espacial e temporal da SOCE por imagem confocal de fibras musculares mecanicamente pelados também é descrito.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

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Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

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Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

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Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

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