Name: fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

Мы благодарим доктора Ноа Вайследер для чтения и редактирования этой рукописи. Эта работа была поддержана Исследовательские гранты Фонда UMDNJ 62-09 в ZP, Американской ассоциации сердца SDG2630086 на XZ, 0535555N БМ, и Национальными Институтами Здоровья RC2AR058962-01 Мб.

<ol>
	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29.">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li><li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+in+skeletal+muscle.">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells.">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li><li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+intracellular+Ca2++by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor.">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li><li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+store-operated+Ca2++entry+and+altered+Ca2++release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes.">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li><li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Несмотря на возбуждение волн для Ca 2 +-связывающих и Ca 2 + бесплатный Фура-2, 340 нм и 380 нм, соответственно, лучшее соотношение динамического диапазона Фура-2 Ca 2 + измерения концентрации может произойти и на других длинах волн в той или иной микроскопа. Такие изменения в длине волны, как правило, в связи с изменениями в оптическом тракте с добавлением различных оптических компонентов. В этом исследовании возбуждения волн для Фура-2 были определены 350 нм и 390 нм, выполняя спектральный анализ Фура-2 флуоресценции. Внутриклеточного Са 2 + уровня в цитозоле результаты баланс из нескольких источников, в том числе внутриклеточного Са 2 + релизе, внеклеточный Са 2 +, а также Ca 2 + механизм исключения на мембране ER и плазмы. Для выделения однонаправленных SOC-опосредованной Са 2 + из внутриклеточных приток Ca 2 + и освобождение Са 2 + дрожusion, Mn 2 + закалка анализ может быть использован. Mn 2 +, как известно, чтобы иметь возможность проникать в клетки через SOCE, но непроницаемой для экструзии поверхности мембраны или ER поглощение Са 2 + насосов. Таким образом, тушение флуоресценции представляет собой измерение однонаправленной Mn 2 + в клетки поток, который оценивает степень активации SOCE. Mn 2 + закалка анализ выполняется на изобестической точки, при такой длине волны Фура-2 интенсивность флуоресценции не зависит от концентрации Са 2 +. Изобестической точки для каждой системы должны быть определены спектр сканирования. Кроме того, Mn 2 + тушение могут быть записаны скорректированный флуоресценции при любых двух длинах волн таким образом, что окончательное значение не зависит от концентрации Са 2 + 13. Чтобы получить пространственную и временную информацию о деятельности SOCE в скелетных мышцах, мы использовали двойные краски методом, который позволяет одновременно measuremeП о SOCE деятельности и SR Са 2 + в кожа взрослого млекопитающего EDL мышечных волокон. Корреляция между изменениями в СР Са 2 + содержание и SOCE деятельности могут быть построены, чтобы указать порог и чувствительность SOCE активации к истощению SR Ca 2 + хранения. TT-загрузки Решение оптимизировано дополнительно загрузить Т-трубочки с Са 2 + и для грунтования Т-канальцев и SR-загрузки решения, направленные на содействие максимальной SR Ca 2 + загрузки и дополнительно загрузить Т-трубочки с ~ 500 мкМ Са 2 +. FCCP входит в TT / SR-загрузки решения и SR-слой решение по ликвидации последствий от митохондрий.

Таблица специфических реагентов и оборудования: <table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Хэма F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Блюдо со стеклянным дном </td><td> Маттек </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Фура-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, уплотнения плотно, защищенном от света, растворяется в ДМСО </td></tr><tr><td> Fluo-5N утра </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, уплотнения плотно, защищенный от лIGHT </td></tr><tr><td> Род-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, уплотнения плотно, защищенном от света </td></tr><tr><td> Кварцевые кюветы </td><td> Starna клетки </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> тапсигаргин </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-бензил-п-толуол сульфаниламидами (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Коллагеназы I типа </td><td> Сигма </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Оборудование: <ol><li> Spectrofluorometer (Photon Technology International, Нью-Джерси): ксеноновая дуговая лампа, управляемая компьютером высокоскоростной монохроматор случайный доступ, кюветы на основе монохроматора излучение, Nikon TE-200 перевернутый флуоресценции микротрещине, S Fluor 40x/1.30 нефти цели, ФЭУ детекторов. </li><li> Лазерное сканирование конфокальной микроскопии (BioRad Radiance2100): 453/477/488/514 аргоновый лазер, гелий-неоновый лазер 543nm, Nikon TE2000 инвертированного микроскопа, 60X цель (NA 1.4, масло). </li><li> Стереомикроскопа с увеличением мощности&gt; 100 (Zeiss Apo Stemi SV11). </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Степень магазин управлением Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Запись (SOCE) можно контролировать с помощью флуоресцентного Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; Показателям. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Тушение таких показателей анализов SOCE в культуре клеток и скелетные мышечные волокна. Методика, позволяющая пространственным и временным разрешением SOCE по конфокальной микроскопии механически кожу мышечных волокон также описано.

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Очистка прародителей из скелетных мышц

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Оценка кальция Sparks в малонарушенных скелетных мышечных волокон

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Измерение флуктуаций кальция в пределах саркоплазматического ретикулума культивируемых клеток гладкой мышцы с использованием FRET на основе конфокальной микроскопии

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Жить клеточной изображений грибковых клеток расследовать режимы записи и внутриклеточных локализации дефензинов противогрибковые завод

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Выделение высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей для одновременного измерения переходных процессов Ca2+ и кальциевого тока L-типа

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Живая визуализация динамики микротрубочек в клетках глиобластомы, вторгающихся в мозг рыбок данио

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...