Name: fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Noah Weisleder para la lectura y la edición de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación Fundación UMDNJ 62-09 a ZP, la American Heart Association SDG2630086 de XZ, 0535555N a MB, y los Institutos Nacionales de Salud RC2AR058962-01 a MB.

<ol>
	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29.">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li><li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+in+skeletal+muscle.">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells.">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li><li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+intracellular+Ca2++by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor.">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li><li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+store-operated+Ca2++entry+and+altered+Ca2++release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes.">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li><li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Aunque las longitudes de onda de excitación para el Ca 2 +-unión y Ca 2 + libre Fura-2 son 340 nm y 380 nm, respectivamente, el rango dinámico mejor relación de Fura-2 para el Ca 2 + medición concentración puede ocurrir en otras longitudes de onda en un determinado microscopio sistema. Estos cambios en la longitud de onda son por lo general debido a los cambios en la trayectoria óptica con la adición de diversos componentes ópticos. En este estudio, las longitudes de onda de excitación para Fura-2 se determinó como 350 nm y 390 nm mediante la realización de análisis espectral de Fura-2 fluorescencia. El nivel intracelular de Ca 2 + en el citosol de los resultados de un saldo de varias fuentes, incluyendo intracelular de Ca 2 + en libertad, extracelular de Ca 2 + de entrada, así como de Ca 2 + mecanismo de exclusión en la membrana del RE y de plasma. Para aislar el unidireccional SOC mediada por Ca 2 + afluencia de Ca 2 + intracelular de liberación de Ca 2 + extrusion, el Mn 2 ensayo temple + puede utilizarse. Mn 2 + se sabe que es capaz de penetrar en las células a través SOCE pero es impermeable a la extrusión superficie de la membrana o la absorción de ER por Ca 2 + bombas. Por lo tanto, extinción de fluorescencia representa una medición de unidireccional Mn 2 + flujo en células que calcula el grado de activación de SOCE. Mn 2 + ensayo enfriamiento se realiza en el punto isosbéstico, en tal longitud de onda Fura-2 intensidad de fluorescencia es independiente de la concentración de Ca 2 +. El punto isosbéstico para cada sistema debe ser determinada por análisis de espectro. Alternativamente, Mn 2 + temple puede ser registrada por fluorescencia ajustada en cualquiera de las dos longitudes de onda de tal manera que el valor final es independiente de la concentración de Ca 2 + 13. Para obtener la información espacial y temporal de la actividad de SOCE en los músculos esqueléticos, se empleó un método de doble medio de contraste, que permite MeasureMe simultáneant de la actividad SOCE y SR Ca 2 + en el contenido de piel de mamíferos adultos fibras musculares EDL. La correlación entre los cambios en la SR Ca 2 + contenido y la actividad SOCE se pueden trazar para indicar el umbral y la sensibilidad de activación de SOCE al agotamiento de la Ca 2 + almacenamiento SR. La solución de TT de carga está optimizado para cargar, además, los túbulos T con Ca 2 + y para la maduración de los túbulos T y la solución de SR de carga está diseñada para promover la máxima SR Ca 2 + y de carga para cargar, además, los túbulos T con aproximadamente 500 mM de Ca 2 +. FCCP está incluido en la solución de TT / SR-carga y la solución SR agotan para eliminar los efectos de las mitocondrias.

Tabla de reactivos y equipos específicos: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10 a 040 CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10 a 080 CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio placa inferior </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 PM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, sellado hermético, protegido de la luz, se disolvió en DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, sellado hermético, protegido de lDERECHO </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, sellado hermético, protegido de la luz </td></tr><tr><td> Cubeta de cuarzo </td><td> Las células Starna </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-bencil-p-tolueno sulfonamida (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa tipo I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Equipos: <ol><li> Un espectrofluorómetro (Photon International Technology, New Jersey): lámpara de xenón de arco, controlado por ordenador de alta velocidad monocromador de acceso aleatorio, basado en la cubeta de emisión monocromador, Nikon TE-200 de fluorescencia invertido microscópicasE, S Fluor 40x/1.30 objetivo de aceite, los detectores de PMT. </li><li> Microscopio confocal de barrido láser (BioRad Radiance2100): 453/477/488/514 con láser de argón, láser HeNe 543nm, Nikon TE2000 microscopio invertido, el objetivo de 60X (NA 1,4, el aceite). </li><li> Un microscopio estereoscópico con una potencia de magnificación&gt; 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo). </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

Tienda operada de Ca 2 + entrada (SOCE), antes denominado capacitiva de entrada de Ca 2 +, es un mecanismo estrictamente regulado por la afluencia de Ca 2 + extracelular en las células para reponer retículo agotado endoplasmático (ER) o retículo sarcoplásmico (SR) de Ca 2 + tiendas 1,2. Desde Ca 2 + es un segundo mensajero en todas partes, no es sorprendente ver que SOCE juega un papel importante en una variedad de procesos celulares, incluyendo la proliferación, la apoptosis la transcripción de genes, y la motilidad. Debido a su gran incidencia en casi todos los tipos de células, incluyendo las células epiteliales y de los músculos esqueléticos, esta vía ha recibido un gran interés 3,4. Sin embargo, la heterogeneidad de las características de Soce en diferentes tipos de células y la función fisiológica aún no están claras 5-7. Las propiedades funcionales de los canales de SOCE puede ser revelada por los estudios de patch-clamp, mientras que una gran cantidad de conocimiento acerca de thivía s se ha ganado por fluorescencia basados ​​en Ca 2 + intracelular mediciones debido a su conveniencia y la viabilidad de selección de alto rendimiento. El objetivo de este informe es un resumen de algunos de fluorescencia basada en métodos para medir la activación de SOCE en la monocapa de células, células en suspensión y fibras musculares 5,8-10. El más utilizado de estos métodos de fluorescencia es supervisar directamente la dinámica de la Ca 2 + intracelular utilizando la relación de F y F 340 nm 380 nm (510 nm para la emisión de longitud de onda) de la radiométrica de Ca 2 + indicador Fura-2. Para aislar la actividad de SOCE unidireccional de Ca 2 + intracelular de liberación de Ca 2 + de extrusión, un ensayo de Mn 2 + enfriamiento se utiliza con frecuencia. Mn 2 + se sabe que es capaz de penetrar en las células a través SOCE mientras que es impermeable a los procesos de extrusión de superficie de membrana o de la absorción de ER por Ca 2 + bombas, debido a su ingenio afinidad muy altah Fura-2. Como resultado, el temple de Fura-2 fluorescencia inducida por la entrada de Mn 2 + extracelular en las células representa una medición de la actividad de SOCE 9. Medición radiométrico y el Mn +2 ensayos enfriamiento se puede realizar en un espectrofluorómetro cubeta basado en un modo de población de células o en un sistema basado en microscopio para visualizar las células individuales. La ventaja de las mediciones de una sola célula es que las células individuales sometidos a manipulaciones genéticas se pueden seleccionar con las buenas prácticas agrarias o de los periodistas RFP, lo que permite estudios en células modificadas genéticamente o mutado. Las características espacio-temporales de SOCE en el músculo esquelético estructuralmente especializado se puede lograr en las fibras musculares de piel por simultáneamente el control de la fluorescencia de dos baja afinidad Ca 2 + indicadores destinados a los compartimientos específicos de la fibra muscular, tales como Fluo-5N en el RE y los Rhod 5N en la transversal túbulos 9,11,12.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

La extensión de la tienda que funciona con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Entrada (SOCE) se puede controlar usando fluorescentes Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicadores. Minnesota<sup&gt; 2 +</sup&gt; Temple de tales indicadores SOCE ensayos en células cultivadas y las fibras del músculo esquelético. Una técnica que permite la resolución espacial y temporal de SOCE por la imagen confocal de las fibras musculares mecánicamente aisladas, también se describe.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Investigación

Biología

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Imágenes de células vivas de células fúngicas a investigar los modos de entrada y localización subcelular de defensinas de plantas antifúngicas

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma que invaden el cerebro del pez cebra

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...