Name: fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

Biz okuma ve bu yazının düzenleme için Dr Nuh Weisleder teşekkür ederim. Bu çalışma MB 0535555N ZP, XZ için Amerikan Kalp Derneği SDG2630086, ve Ulusal Sağlık Enstitüleri RC2AR058962-01 MB için Araştırma Fonları UMDNJ 62-09 Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Parekh, A. B., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+calcium+channels.">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel.">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice:+roles+of+store-operated+Ca2++entry+in+the+immune+system+and+beyond.">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29.">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li><li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+in+skeletal+muscle.">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li><li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells.">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li><li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+intracellular+Ca2++by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor.">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li><li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+store-operated+Ca2++entry+and+altered+Ca2++release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes.">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li><li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2++entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor.">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li><li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+relationships+between+Ca2++store+mobilization+and+Ca2++entry+in+an+exocrine+cell.">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ca + 2-bağlayıcı ve Ca2 + serbest Fura-2 uyarma dalga boyları sırasıyla, 340 nm ve 380 nm olmasına rağmen, Ca 2 için Fura-2 iyi oranı dinamik aralığı + konsantrasyonunun ölçülmesi belirli bir başka dalga boylarında oluşabilir mikroskop sistemi. Bu tür değişimler dalga boyunda genellikle farklı optik bileşenlerin ilavesi ile optik yol üzerinde değişikliklere bağlı bulunmaktadır. Bu çalışmada, Fura-2 için uyarma dalga Fura-2 floresans spektral analizi yaparak 350 nm ve 390 nm olarak belirlendi. Dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan arasında bir denge, gelen sitozolüne sonuçlar intraselüler Ca2 + seviyesi intraselüler Ca2 + serbest bırakma, hücre dışı Ca2 + giriş yanı sıra, ER ve plazma membranında Ca2 + dışlama mekanizmasıdır. Hücre içi Ca 2 + sürümü ve Ca 2 + extr gelen tek yönlü SOC-aracılı Ca 2 + akını izole etmek içinusion, Mn 2 + soğutmadan test kullanılabilir. Mn 2 + SOCE yoluyla hücre içine nüfuz edebilmek için bilinen ama yüzey membran ekstrüzyon veya Ca 2 ER alımı + pompaları geçirmeyen edilir. Bu nedenle, flöresan söndürmesiyle SOCE aktivasyon derecesi tahmin hücrelerin içine tek yönlü Mn 2 + akısı bir ölçüm temsil eder. Mn 2 + soğutmadan deneyi gibi dalga boyunda, isosbestic noktada gerçekleştirilir Fura-2 floresans yoğunluğunu Ca2 + konsantrasyonu bağımsızdır. Edilir Her sistem için isosbestic noktası spektrum taraması ile tespit edilir. Alternatif olarak, Mn 2 + soğutmadan son değere Ca2 + konsantrasyonu 13 bağımsız şekilde herhangi iki dalga boyunda ayarlanmış floresans tarafından kaydedilebilir. Iskelet kaslarında SOCE faaliyet zamansal ve mekansal bilgi almak için, simultane ölçüm tekni sağlayan bir çift boya yöntemi, istihdamSOCE aktivite ve SR Ca 2 tenli yetişkin memelilerin EDL kas liflerinin + içerik nt. SR Ca 2 değişimler arasındaki ilişki + içeriği ve SOCE aktivite SR Ca 2 tükenmesi + depolama SOCE aktivasyon eşiği ve duyarlılık göstermek için çizilebilir. TT-yükleme çözüm ek Ca 2 T-tubul yüklemek için optimize edilmiştir + ve T-tubul ve SR-yükleme çözüm priming için maksimal SR Ca 2 + yükleme teşvik etmek ve ayrıca T-tubul yüklemek için tasarlanmıştır ~ 500 uM Ca 2 ile +. FCCP TT / SR-yükleme çözümü ve mitokondri gelen etkileri ortadan kaldırmak için SR-tüketen bir çözüm bulunur.

Özel reaktifler ve ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Bulaşık </td><td> MatTek Corp </td><td> P35G-1,5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C&#39;de, DMSO içinde çözülmüş ışıktan korunan conta sızdırmaz, </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, mühür sıkı, l korunmaktadıright </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, mühür sıkı ve ışıktan korunmalıdır </td></tr><tr><td> Kuvars Küvet </td><td> Starna Hücreleri </td><td> 3-S-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-benzil-p-toluen sülfonamid (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Ekipman: <ol><li> Bir spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): ksenon ark lambası, bilgisayar kontrollü yüksek hızlı rastgele erişim monokromatör, küvet tabanlı emisyon monokromatör, Nikon TE-200 ters floresans MikroskopE, S Fluor 40x/1.30 yağlı objektif, PMT dedektörleri. </li><li> Argon lazer 453/477/488/514, HeNe lazer 543nm, Nikon TE2000 inverted mikroskop, 60X objektif (NA 1.4, yağ): Lazer Konfokal Mikroskobu (BioRad Radiance2100) tarama. </li><li> Bir büyütme gücü&gt; 100 (Zeiss STEMI SV11 Apo) ile bir stereomikroskop. </li></ol>

fluorescence-based measurement of store-operated calcium entry in live cells: from cultured cancer cell to skeletal muscle fiber

Mağaza önceki kapasitif Ca 2 + girişi olarak adlandırılan, Ca 2 + girişi (SOCE) ameliyat, + tükenmiş endoplazmik retikulum (ER) veya sarkoplazmik retikulum (SR) Ca 2 + depolarının doldurulmasıdır hücre içine ekstraselüler Ca 2 akını için sıkı regüle mekanizmadır 1,2. Ca 2 + bir yerde ikinci bir haberci olduğu için, o SOCE çoğalması, apoptoz, gen transkripsiyonu ve motilite dahil, hücresel süreçlerin çeşitli önemli rol oynar görmek şaşırtıcı değildir. Epitel hücreleri ve iskelet kasları dahil olmak üzere hemen hemen tüm hücre tipleri, içinde geniş görülmesi nedeniyle, bu yolu büyük ilgi 3,4 aldı. Ancak, farklı hücre tipleri ve fizyolojik fonksiyonu SOCE özellikleri heterojenite hala 5-7 net değil. SOCE fonksiyonel kanal özellikleri thi hakkında bilgi büyük bir gövde ise, yama klemp çalışmalarla ortaya edilebilirs yolu çünkü yüksek verimli tarama rahatlığının ve fizibilite floresans tabanlı hücre içi Ca 2 + ölçümleri ile elde edilmiştir. Bu raporun amacı, tek tabakalı hücreler, askıya hücreleri ve kas lifleri 5,8-10 içinde SOCE aktivasyonu ölçmek için bir kaç floresans tabanlı yöntemler özetlemektir. En yaygın olarak floresans bu yöntem kullanılır, doğrudan intraselüler Ca2 + dinamiği izlemek için F ve 340 nm oranlı metrik Ca2 + göstergesi Fura-2 F 380nm (emisyon dalga boyu için 510 nm) oranı kullanılarak bir. Hücre içi Ca2 + serbest bırakılması ve Ca arasından 2 yönlü SOCE aktivitesini izole etmek için + ekstrüzyon, bir Mn 2 + soğutmadan assay sıkça kullanılır. Mn 2 + o yüzeye membran ekstrüzyon süreçlere veya Ca 2 tarafından ER uptake geçirmez iken SOCE yoluyla hücre içine nüfuz edebilir olduğu bilinmektedir + olan çok yüksek bir afiniteye wit nedeniyle pompalarh Fura-2. Bunun sonucu olarak, + hücrelerine ekstraselüler Mn 2 girişi ile indüklenen Fura-2 floresans soğutmadan SOCE 9 faaliyeti, bir ölçüm temsil eder. Oranlı metrik ölçümü ve Mn +2 soğutmadan deneyleri, bir hücre popülasyonunu modunda ya da tek hücrelerin canlandırmak için mikroskop tabanlı bir sistem içerisinde bir küvet bazlı spectrofluorometer üzerinde gerçekleştirilebilir. Tek hücre ölçümlerin avantajı gen manipülasyonu tabi tek tek hücrelerin genetik olarak modifiye edilmiş ya da mutasyon hücrelerinde çalışmaları sağlayan GFP veya RFP gazetecilere kullanılarak seçilebilir olmasıdır. Yapısal olarak özel bir iskelet kasında SOCE arasında zamanmekansal özellikleri aynı anda iki düşük afinite Ca 2 floresans izlenerek kabuklu kas fiberler elde edilebilir SR ve bu gibi flüoresan 5N olarak kas fiberin özel bir bölme, hedeflenen + göstergeleri Rhod- transvers tübüller 9,11,12 olarak 5N.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber at JoVE.com

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Mağaza çalışan Ca ölçüde<sup&gt; 2 +</sup&gt; Giriş (SOCE) floresan Ca kullanılarak izlenebilir<sup&gt; 2 +</sup&gt; Göstergeleri. Mn<sup&gt; 2 +</supKültür hücreleri ve kas lifleri bu tür göstergeler testler SOCE bir&gt; su verme. Mekanik tenli kas liflerinin konfokal görüntüleme ile SOCE uzaysal ve zamansal çözünürlüğe izin veren bir tekniği de tarif edilir.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...