Name: scale-up of mammalian cell culture using a new multilayered flask
Uploaded: 2011-12-05T13:00:00
Duration: 8 min 39 s
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1. Protocolo a ser usado Multi-Frascos para cultura de células <ol><li> Preparação dos vasos e adição de suspensão de células <ol><li> Prepare meio de crescimento celular, conforme necessário. </li><li> Line up multi-Flask verticalmente em seu lado com a tampa virada para cima na superfície de trabalho (capela de fluxo laminar estéril). <ol><li> Estes estão disponíveis em frascos de 3 e 5 camadas formatos e usar um padrão de fluxo de trabalho semelhante a um balão de T-175. </li></ol></li><li> Solte e remova as tampas. Adicionar a quantidade necessária de pré-aquecido médio em frasco utilizando uma pipeta de 50 ou 100 mL ou por vazamento. <ol><li> Pipetas que são ≤ 10 ml pode chegar ao fundo do vaso quando Multi-Frascos são colocados verticalmente, com tampa virada para cima. Pipetas ≥ 10ml possa chegar até o navio imediatamente após o logotipo no Flask Multi-, proporcionando assim um portal conveniente para adicionar maiores volumes de mídia para navio. </li></ol></li><li> Para evitar bolhas de meio, permitir fluxo de líquido para flow ao longo da parede interna da tampa multi-Flask (logo-side). </li><li> Adicionar suspensão celular a partir de um estoque de células concentrados em meio de crescimento através da camada superior usando uma pipeta de 10 mL e frascos cap. Dicas: - Transporte Multi-Frascos em um carrinho para o site incubadora e executar as etapas restantes. - A densidade de semeadura de células irá variar dependendo do tipo de célula, médio e precisam duração cultura. Comece com a densidade de semeadura e volume de mídia ao usado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5, dependendo do Flask Multi-formato utilizado. </li></ol></li><li> Mistura de células <ol><li> Mix posição: Segure o Flask Multi-ereto com o logotipo voltado para você e vire anti-horário para um ângulo de 45 ° com a porta mix voltado para você. </li><li> Exploração no mesmo ângulo, incline ligeiramente Multi-Flask da frente para trás (pescoço longe de você) até que o líquido na camada superior drena totalmente downwards através da porta mix. Pivot no mix porta lateral. </li><li> Da mesma forma, agite levemente Flask Multi-de trás para frente (pescoço para você) até meio ralos plenamente da camada inferior para a parte superior através da porta mix. Repita os passos 1.2.2 e 1.2.3 mais uma vez para assegurar a mistura adequada. </li><li> Traga Multi-Flask de volta à posição mix (Passo 1.2.1) e prossiga para a Etapa 1,3 </li><li> Alternativamente, suspensão de células podem ser preparados externamente a partir do Flask Multi-e suspensão de células pode ser adicionado ao recipiente utilizando uma pipeta ou por gentil vazamento. <ol><li> Porta permite misturar em recipiente de mistura de células com a mídia e elimina a necessidade de grandes volumes de células em suspensão externamente. </li><li> Ele também permite equalização de mídia em todas as camadas da Flask Multi- </li></ol></li></ol></li><li> Equilíbrio de fluidos <ol><li> Depois de misturar / adição de suspensão de células, coloque Flask Multi-verticalmente sobre uma superfície de trabalho plana para equalizar o volume de líquido equally em todas as camadas. </li></ol></li><li> Líquido partição em cada camada <ol><li> Segure o frasco Multi-com o logotipo voltado para você e gire no sentido horário para um ângulo de 45 ° para particionar o líquido para cada uma das camadas. Dica: - Para melhores resultados, é importante o uso de uma superfície de trabalho apartamento em Passos 1,3-1,4 </li></ol></li><li> Transporte <ol><li> Uma vez que a mídia contendo suspensão de células é particionado, transporte Flask Multi-na mesma 45 ° de ângulo (sentido horário) como no Passo 1.4.1 com a mídia longe do porto mix em incubadora. Esta posição também é adequado ao remover frascos de incubadora para a visualização de um microscópio. </li></ol></li><li> Colocando Multi-Flask em incubadora prateleira <ol><li> Segurando Multi-Flask no ângulo de 45 ° (sentido horário, longe da porta-mix), gentilmente gire-o para baixo horizontalmente na superfície incubadora (usando o canto longe do porto como um mixpivot). Lay Multi-Frasco com logotipo voltado para cima. <ol><li> Falcon design Multi-Flask permite que navios a serem empilhados e os mantém no lugar por uma costela resistente empilhamento. </li></ol></li></ol></li><li> Distribuição das células e reagentes <ol><li> Depois de colocar Multi-Flask sobre uma superfície plana de trabalho, gentilmente rock e para trás e para os lados para distribuir uniformemente as células em superfícies de cultura de tomar cuidado para não derramar líquido de cada camada. Pilha de frascos. <ol><li> Este balão é feito de material translúcido e células sobre a última camada pode ser facilmente visualizado em um microscópio. </li></ol></li></ol></li><li> Media Exchange <ol><li> Aspirar enquanto inclinando Flask Multi-o para a esquerda (mistura de porta-side) com o logotipo voltado para você. </li><li> Em seguida, incline o frasco Multi-à direita, continuando a aspirar todos os meios de comunicação residual. </li><li> Adicionar a quantidade apropriada de mídia e siga as etapas 1,3-1,7 </li></ol></li></ol> 2.Colheita de células multi-Frascos <ol><li> Dissociar células, line up Multi-Frascos verticalmente e levar cada um a posição Mix (Passo 1.2.1). Inverta suavemente frascos com pescoço de frente para você, de modo a permitir que a media de drenagem para a camada superior da Multi-Flask. </li><li> Inserir um 5 ou 10 mL ponta de aspiração através do pescoço até chegar a nível de líquido perto do porto mix. Aspirar meio esgotado. </li><li> Adicionar dissociação tampão reagente / lavar e trazer para Mix posição como no Passo 1.2.1, então prossiga e siga os passos de 1,3-1,7. Neutralize com meio de crescimento / agente neutralizante e despeje suspensão de células em um tubo de receber ou inverter frasco de modo que as células de drenagem para a camada superior do navio e recolher as células usando uma pipeta de 10 mL. Dica: Para aumentar a recuperação de células ou reagentes, trazer Multi-Flask para misturar posição (Passo 1.2.1), inverta com o pescoço para operador para permitir a drenagem completa de mídia da Al<html> l camadas para a camada superior. Então, Flask Multi-inclinação no sentido horário para ângulo de 45 ° (longe da porta mix) enquanto o Flask Multi-permanece invertida. Use uma pipeta (10-10 mL) para coletar os reagentes restantes. </li></ol> 3. Recomenda volume de trabalho na Falcon Multi-Frascos Meio de crescimento 3-Layer: 75-150 mL por Multi-Flask 5-Layer: 125-250 mL por Multi-Flask Dissociação agente Layer-3: ≥ 15 mL por Multi-Flask 5-Layer: ≥ 25 mL por Multi-Flask Dica: Comece com um volume de meio utilizado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5 vezes, dependendo do Flask multi-formato avaliados para que mL por unidade de superfície continua a mesma. 4. Resultados representativos: 1. Projeto de Falcon Flask Multi- files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Flask Multi-Cultura de Células embarcações estão disponíveis em uma 3 - e 5-camada formato empilhável para scale-up de células fornecendo 525 e 875 cm 2 de superfície de crescimento, respectivamente. Pipeta de acesso facilita a adição e remoção de células e reagentes em e fora do navio. Presença de port-mix permite rápida em recipiente de mistura e equalização de media em todas as camadas da Multi-Flask. 2. Rendimento das células usando multi-Flask: Estas embarcações estão disponíveis em 3 camadas e 5 camadas formatos que correspondem a 3 e 5 vezes a área da superfície da T-175 frascos. Assim, ≥ 3 e 5 vezes (130 ± 6,8 x 10 6 e 218 ± 23,6 x 10 6 células, respectivamente) o número de BHK-21 (baby hamster kidney), as células foram cultivadas e se recuperou de Multi-Flask comparado a T-175 frascos (43,2 ± 3,5 x 10 6 células; Fig.2A). Rendimento celular por unit área de superfície era equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP (humanas da próstata linhagem celular de adenocarcinoma), Hep-G2 (linha celular humana hepatocarcinoma), Ecopack 2-293 (humanos linhagem de células renais) cultivadas por um período de 48-96h (Fig.2B) em meio de crescimento (35 ml por camada), como recomendado pelo fornecedor de células (ATCC, Sigma e / ou Clontech). As células foram enumeradas em um contador de Vi-CELL automatizado (1). <img alt="Figura 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg" /> Figura 2A: três e cinco vezes o número de células BHK-21 foram cultivadas e se recuperou de 3 - e 5-layer Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos. Rendimento esperado foi determinado utilizando rendimento celular média do controle T-175 frascos multiplicado por três e cinco vezes para a 3 - e 5-layer Multi-Frascos, respectivamente (n = 4 frascos / formato). <img alt="Figura 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg" /><br/&gt; Figura 2B: rendimento das células por cm 2 foi equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP, HepG2 e EcoPack2-293 células. Cada barra representa média de 4-6 frascos. Células BHK-21 (11.000 cells/cm2) foram cultivadas por 72 horas, as células LNCaP (20.000 cells/cm2) e EcoPack2-293 células (~ 35.000 cells/cm2) foram cultivadas por 96 horas e HepG2 células (25.000 células / cm 2 ) foram cultivadas por 48 horas antes da colheita. 3. Distribuição de mídia entre camadas de Multi-Flask Meio de cultura de células (DMEM; Invitrogen) foi adicionado em 5 camadas Multi-Frascos (250 mL/5-layer navio) e dividida em camadas de acordo com protocolo descrito acima. Distribuição de mídia foi medido por furos em cada camada e mídia bombeado para fora de camadas individuais. Peso de líquido recuperado de cada camada foi encontrado para ser relativamente uniforme de camada a camada, como mostrado na Figura 3. Eles são os seguintes: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg" /> Figura 3. Uniform distribuição de mídia em cada uma das cinco camadas de uma camada de 5-Multi-Flask. Meio de cultura celular foi adicionado em Multi-Frascos (250 navio ml/5-layer), equilibrada e dividida em camadas individuais. A mídia foi bombeado para fora através de buracos perfurados em camadas individuais e peso líquido foi gravado a partir de cada camada (n = 6 frascos). 4. Distribuição celular entre as camadas de Multi-Flask As células podem ser adicionados e misturados dentro da Multi-Flask. Nós distribuição simulada de células entre as camadas de Multi-Flask usando pérolas (10μm; PolySciences Inc.), semelhante em tamanho às células. Suspensão de esferas foi adicionado em Multi-Flask navio utilizando uma pipeta de 10 mL através da camada superior e misturado com a mídia no vaso como described no protocolo acima. Distribuição de talão foi medido por furos em cada camada e fluido contendo suspensão de esferas foi bombeado para fora de camadas individuais. Concentração talão recuperado de cada camada foi lido em um contador Coulter e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 camadas Multi-Frascos (Fig.4A). A mistura de porta-permite a distribuição homogênea de células e reagentes entre Flask Multi-camadas. <img alt="Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg" /> Figura 4A: distribuição do grânulo em cada uma das três camadas de uma camada de 3-Multi-Flask. Uma suspensão de grânulos (3,6 x10 6 / ml) foi adicionado ao meio dispensada em Multi-Frascos (suspensão de esferas: volume de mídia é 1:10, vol: vol) e mistos, seguido pelo equilíbrio e as etapas de partição utilizando o protocolo descrito. Concentração talão recuperado de cada camada (meio bombeado através de furos em cada camada) foi lido em uma contagem Coulterer e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 - Multi-layer Frascos (n = 5 frascos) Mostrados abaixo são imagens representativas de Ecopack 2-293 padrões de coloração de células cultivadas em&gt; confluência de 80% em 3 camadas de Multi-Frascos em meios de crescimento suplementado. Monocamadas de células foram fixadas e coradas com cristal violeta e Multi-camadas Flask foram então cortadas e imagens digitalizadas (2). Nota padronização celular, foi homogênea em todas as camadas da Flask-Multi (Fig.4B). Resultados semelhantes foram obtidos com vários tipos de células avaliados (dados não mostrados). <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg" /> Figura 4B: Esta figura ilustra o crescimento de células homogêneas entre as camadas de Multi-Frascos. Ecopack-2-293 células cultivadas a&gt; confluência de 80% em 3-Multi-camada de frascos e T-175 foram fixados e corados com violeta de cristal. Multi-Flask vasos foram cortados e cada camada manchada foi digitalizada. 5 Air oferta em Flask-Multi.: Análise de media gasto com BioProfile FLEX analisador (3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 células cultivadas por 96 horas não revelou nenhuma diferença na saturação do ar de células cultivadas em 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambiente O 2). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg" /> Figura 5: Air saturação (% ambiente O 2) dos meios de comunicação passaram foram semelhantes em pré-mixed media de 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos. EcoPack2-293 células foram semeadas a uma densidade de 35.000 células / cm 2 e cultivadas por 96 horas antes da análise de media (n = 3 frascos).

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Todos os autores são funcionários da Becton Dickinson, Segmento de Biociências, Discovery Unidade Labware.

O presente estudo demonstra o aumento da produtividade que a concepção Flask Multi-oferece aos pesquisadores. Embora seja importante seguir as etapas descritas anteriormente para desempenho otimizado ao usar Multi-Frascos, há poucos passos críticos neste protocolo que são considerados mais essenciais. Estes incluem: (i) mistura de células e reagentes usando a porta mix dentro do vaso (ii) o transporte de Multi-Flask em um ângulo de 45 ° no sentido horário após particionamento líquido para cada uma das camadas (iii) que Flask-Multi pós plano de particionamento para o incubadora. Uso adequado de Multi-Flask leva à produção de uma população de células homogêneas dentro de cada navio que é cultivada em um ambiente que é congruente a T-175 frascos (5). Estas embarcações fornecer células 3 e 5 vezes mais em um espaço semelhante ao do frasco T-175. O navio 3 e 5 camadas fornece 525 e 875 centímetros 2 de área de crescimento, respectivamente, e oferecem espaço e trabalho savings para os usuários. Tratamento de superfície de tecido Cultura é comparável ao padrão frascos permitindo scale-up, sem a necessidade de re-otimização das condições de cultura existente ou comprometer a homogeneidade, qualidade ou desempenho de células (6, 7). Isto também prevê a comparabilidade com os dados coletados anteriormente. Esses vasos podem ser também revestido com reagentes tais como colágeno, fibronectina, poli-D-lisina para fornecer um substrato para o crescimento especializados apego e diferenciação de certos tipos de células, tais como hepatócitos 8, 9 kertainocytes, células-tronco cultivadas em soro de mídia livre formulações. Soluções de revestimento pode ser removido com a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de reagentes valiosos, bem como a remoção eficaz de solução de revestimento antes de a cultura de células. O recomendado volume de mídia ideal para células de cultura em frascos multi-faixa ,142-0,287 ml / cm 2, que se traduzem em 25-50 ml por camada. Ao contrário de um outro frasco de múltiplas camadas, tseu produto oferece uma combinação porta-in que permite que a embarcação rápida no vaso de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio. Linhagens de células diversas, culturas primárias e células-tronco foram ampliados de forma eficiente usando Multi-Frascos. Estes navios são particularmente vantajoso em aplicações que exigem um grande número de células, como no alto throughput screening, a produção de vacinas, transfections vetor viral e terapia celular. Economia de tempo, espaço, trabalho e geração de resíduos são reduzidos ganhos chave do Flask multi-versus culturas convencionais em vasos de camada única. Podemos cultura cerca de três vezes o número de células colhidas de 5, T-175 frascos no mesmo espaço, com 3, 5 camadas Multi-Frascos. Esta vantagem na economia de espaço não se limita apenas a T-175, mas também pode ser estendido para outros navios: um aparelho de garrafa padrão rolo que se encaixa em incubadoras de casas comuns de laboratório rol ~ 4garrafas de Ler (2200 ml) cada um dos quais fornece 850 centímetros 2 de superfície. Na mesma área, ~ 20, 5 camadas Multi-Frascos podem ser alojados proporcionando assim cinco vezes a superfície de crescimento para células de cultura. Além disso, com um aumento do &quot;Go-Green&quot; consciência, opções para reduzir a geração de resíduos é altamente desejável. A esse respeito, há um 38% (5, T-175 frascos pesam ~ 640g enquanto que uma, Flask Multi-5 camadas pesa ~ 400g) diminuição da geração de resíduos utilizando Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos e levar essas vantagens a diminuir em armazenamento dos resíduos e custos de eliminação e resultar em economia de custos para o usuário.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 3 camadas de cultura de tecidos tratados com 525 centímetros 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences Cultura de Células - BD Falcon Multi-Frascos</a> </td></tr><tr><td> 5 camadas da cultura de tecidos tratados 875 centímetros 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ml pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10 ml de pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml de aspiração pipeta </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 tubo de polipropileno ml cônico </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 Tecido frasco Cultura tratados com </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gram Cristal Violeta </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Triptose fosfato Caldo </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> Células BHK-21 </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Bead poliestireno </td><td> PolySciences Inc. </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Flex Profile Analyzer </td><td> Nova BioMedical </td><td></td></tr></tbody></table>

scale-up of mammalian cell culture using a new multilayered flask

Um número crescente de aplicações baseadas em células requerem um grande número de células. Utilização de camada única T-frascos, que são adequados durante a pequena escala de expansão, pode tornar-se complicado, trabalhoso e demorado quando um grande número de células são obrigatórios. Para atender a essa necessidade, o desempenho de um novo navio cultura multi-camadas de células para facilitar escala fácil de células da camada única T-frascos serão discutidos. Os frascos testados estão disponíveis em 3 - e 5-camada formato e permitir que a cultura ea recuperação completa de três e cinco vezes o número de células, respectivamente, em comparação com T-175 frascos. Uma característica chave do BD Flask Multi-é uma porta de mix / equilíbrio que permite rápida em recipiente de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio e consistentemente produzem células que podem ser cultivadas em um ambiente que é congruente a T-175 frascos. O projeto destes frascos Multi-também permite cacesso pipeta onvenient para adicionar reagentes e células diretamente no frasco, bem como a recuperação eficiente de células valiosas e reagentes e reduz o risco de contaminação devido a vazamento. Para aplicações onde o vazamento é preferível a pipetagem, o projeto permite a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de valiosas células e reagentes.

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Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Células desempenham um papel fundamental e crescente na pesquisa e na descoberta e desenvolvimento de novas terapêuticas. Com esta crescente necessidade de maior número de células que precisam de maneiras mais eficientes e eficazes para o cultivo e colheita de células apego dependente. Um frasco de múltiplas camadas com as características certas pode servir a esse propósito.

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