Name: fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende den støtte til følgende forskningsrådene og tilskud: EPSRC, HFSP, National Research Foundation Korea (Grant Number R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

1. Microchip opspind <ol><li> SU8 mester opspind. For at få mikrofluid kanaler på 40 μm højde, spin pels SU8-50 (MicroChem Corp) på en Si wafer ved 3000 rpm i 30 s. Soft bages på en varm-plade ved 65 ° C i 5 minutter og 95 ° C i 30 minutter for at fordampe opløsningsmidlet og densify filmen. Efter nedkøling, udsætte SU8 modstå med 360-440 nm stråling ved 300 mJ / 2 under passende maske. Efter eksponering, bage wafer ved 65 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 4 minutter. Efter afkøling de eksponerede områder (Micrpoposit EF opløsningsmiddel, Chestech) i 5 minutter udvikler, med omrøring. 5 Brug frisk EF-solvente til at skylle wafer og derefter tørre det under gas for at generere en ren overflade. Behandl wafer med hexan og methanol vaske. Udfyld SU8 mester fabrikation proces med en afsluttende trin i fordampnings trichlor (1,1,2,2-perfluoocytl) silan på overfladen (i en ekssikkator i 40 minutter). </li><li> PDMS curing, terninger og hulning. At danne strukturerede microfluidic substrater, vi blander Sylgard 184 (Dow Corning) i et 10:1 (w / w) forholdet mellem harpiks til CROSSLINKER og så hæld det over master. Degas i en ekssikkator, og derefter helbrede enheden (øverste lag) i en time ved 65 ° C. Skær hærdet PDMS og flå det af master. Opret adgang huller til fluidisk slange ved hjælp af en biopsi punch. Cure endnu et lag af PDMS (8 g af harpiks jævnt fordelt i en 10x10 cm petriskål) i 20 minutter ved 65 ° C. Læg den forberedte øverste lag på det nederste lag, og derefter hærde natten over ved 65 ° C. Skræl chips fra petriskålen og terninger til brug. </li></ol> 2. Forsøgsopstilling <ol><li> Mikrofluid opsætning <ol><li> Fyld sprøjter (plast eller glas fra Beckton, Dickinson and Company eller fra SGE Analytical Science) med de nødvendige løsninger, som sikrer ikke er luftbobler tilbage i nogen dele af slangen. For dråbe generation to faser anvendes. Den vandige (spredte) har struke indeholder reagenser af renter (for eksempel en suspension af celler i vækstmedie, eller en opløsning af molekylær fluorophores). Olien fase, som i dette tilfælde fungerer som den kontinuerlige fase, er generelt dannet af en blanding af olie og overfladeaktive stoffer, fx 2% Raindance tensid (Raindance Technologies) i fluorerede olie (3M Fluorinert Electronic Liquid FC-40), eller 2% Span 80 (Croda) i Mineral olie. </li><li> Fit slange (Polyethylen rør, Harvard Apparat) af samme indre diameter som sprøjtenålen tips i den ene ende til nåle. Slangen bør afkortes til den kortest mulige længde for at minimere flow ustabile på grund af vibrerende perturbationer. </li><li> Tilslut den anden ende af slangen direkte til huller i PDMS underlaget. Mere komplekse løsninger, såsom brugen af ​​silica kapillær havne eller stik (f.eks Upchurch Nanoports) kan også gennemføres for en mere robust grænseflade mellem mikrofluid enheden og slanger. Tilslut stikkontaktenport af chip til slangen og direkte ind i en opkøber (til affaldsindsamling eller yderligere analyt forarbejdning). </li><li> Monter sprøjter på en sprøjtepumpe (f.eks PHD 4400 Hpsi programmerbare sprøjtepumper, Harvard Apparat) og definere den ønskede infusion af flow-sats for hver fase (normalt på rækkefølgen af ​​mikroliter pr minut). Et minimum andel af olie / vandig flowhastighed på 1 anbefales for at undgå befugtning af PDMS fra den vandige fase, hvilket ville føre til ustabile dråber dannelse (afhængigt af enhedens geometri). Af samme grund er det også anbefales først at skylle oliefase alene, gennem enhver microfluidic kanaler, før indførelsen af ​​den vandige fase. Det endelige setup bruges til eksperimenter heri er illustreret i figur 2a. </li></ol></li><li> Optiske system opsætning <ol><li> Til at undersøge små mængder (ned til et par picoliters) inden for mikrofluid kanaler med høj rumlig og tidslig opløsning bruge en konfokal mikroskop (med automated submicron positionering kapacitet). </li><li> Brug vandopløselige fluorescerende molekyler med ideelt høj kvante udbytte. Excite molekyler ved hjælp af en laser opererer ved en bølgelængde, der passer til optagelsen af ​​de involverede fluoroforen. For eksempel kan fælles fluorescerende molekyler såsom fluorescein 5-isothiocyanat (FITC) og Alexa-Fluor 488 være effektivt begejstret ved hjælp af en 488 nm diode laser (f.eks PicoQuant Gmbh, LDH-pc-485). Fluorescerende molekyler, såsom Texas Red-eller Allophycocyanin (APC) effektivt kan forlades på 633 nm ved hjælp af en He / Ne laser (f.eks Newport R-31425). </li><li> Brug pulserende lasere, der opererer på gentagelse satser på flere MHz (med flere ns puls separation) og fluorophores med tilstrækkeligt differentierede levetid ejendomme til Fluorescence Lifetime Imaging (Flim) eksperimenter. </li><li> Brug beam-styring spejle og optik til at styre strålen højde samt stråle retning. </li><li> Brug en dichroic spejl til at reflektere laserstrålen i mål lENS. Hvis to lasere anvendes samtidig, kan en dual-band dichroic spejl skal installeres for at tillade afspejling af de to laserstråler (fx til 488 og 633 nm bjælker en z488/633rdc spejl fra Chroma Technology Corporation er ideel). </li><li> Brug en uendelighed-korrigeret, høj numeriske blænde (NA) mikroskop målsætning (dvs. Olympus 60 x / 1,2 NA, nedsænkning i vand) for at bringe laserlys til et stramt fokus inden for et mikrofluid kanal. Når du arbejder med høje microchannels (&gt; 100 mM) de anvendte mål må være passende valgt for at sikre, at dens arbejdsmetoder afstand effektivt dækker den fulde højde af mikrokanalplade. </li><li> Saml fluorescens, der udsendes af prøven (inden for mikrofluid kanal) ved hjælp af samme høje NA objektiv og sendes via det samme dichroic spejlet. </li><li> Fjern eventuelle rester af excitation lys ved hjælp af et enkelt eller dual-band emission filter (fx en z488/633 filter fra Chroma Technology Corporation). </li><li> Fokus fluorescens emission på en 75 μm pinhole ved hjælp af et plano-konvekse linse (f.eks 50,2 F; Newport Ltd). Placer pinhole i konfokale plan mikroskopet mål. </li><li> Brug et andet dichroic spejl (f.eks 630dcxr, Chroma Technology Corporation) til at splitte det fluorescerende signal på to detektorer. </li><li> Filter fluorescens afspejles af dichroic spejl med en emission filter (fx en hq540/80 m filter fra Chroma Technology Corporation) og fokusere den med en plano-konvekse linse (fx f = 30,0, id 25,4 mm, Thorlabs) på den første ( »grønne«) detektor. For forsøg med en sekundær rød fluoroforen filtrere fluorescens sendes af dichroic spejlet med en anden emission filter (fx en hq640lp filter fra Chroma Technology Corporation) og derefter fokusere det med en anden plano-konvekse linse på den anden (»røde«) detektor. </li><li> Brug avalanche fotodioder (f.eks AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer) til påvisning af fluorescens fotoner. Det endelige setup er illustreret i <strong&gt; Figur 2b. </li></ol></li></ol> 3. Dråbe generering og dataopsamling <ol><li> Droplet generation metoder <ol><li> Du kan bruge to vigtigste konfigurationer af microchannels at generere dråber: et flow fokus eller et T-kryds format (Figur 3a og 3b) 6,7 Begge metoder er ækvivalente, så længe de dannede dråber er lige så bred som mikrokanalplade selv.. Som et resultat af shear kræfter, der opstår fra at bruge disse geometrier at bringe de to ikke-blandbare væsker sammen og den efterfølgende kapillar instabiliteter, der udvikler sig i grænsefladen, er monodisperse dråber (så små som et par femtoliters) genereres spontant. </li><li> Du kan indkapsle reagenser på forskellige måder: reagenser kan forberedes og blandes ud chip til den ønskede blanding / koncentration, eller de kan blive bragt særskilt i chippen og derefter kombineres forud for dråbe dannelsen (figur 3c). Dettesidste metode giver større fleksibilitet, da blandinger / koncentrationer kan ændres ved blot at tuning den relative flowhastigheder. Det bemærkes, at for celle indkapsling, bør cellesuspensionen i sprøjten omrøres for at undgå kondensering af celler over tidshorisont af eksperimentet. </li></ol></li><li> Fluorescens dataopsamling. <ol><li> Par den elektroniske signal fra lavine fotodiode detektor (beskrevet i 2.2.12) til en multifunktions DAQ enhed til dataopsamling (fx et PCI 6602, National Instruments), der kører på en personlig computer. </li><li> For Flim eksperimenter forbinde detektorer til en tid-Korreleret Single Photon Counting (TCSPC) kort (f.eks TimeHarp 100, PicoQuant GmbH), der kører på en separat PC. Dette kort giver mulighed for fluorescens levetid data, der skal opnås ved en TCSPC metode: alle de fundne fluorescerende foton er korreleret til en hændelse laser puls, og derfor hver udsendte fluorescerende foton er tildelt en tidsforsinkelse. Disse datakan monteres til en enkelt eller multi-eksponentielt henfald kurve for at få en vurdering af fluoroforen / s radiative koefficient / S. Deconvolute de rå data med instrumentet respons funktion (IRF) i detektoren: Dette er opnået ved brug af en lav koncentration auramin-O-løsning (som udstiller en fluorescens levetid på et par picosekunder) 8. </li></ol></li></ol> 4. Cell anerkendelse og kortlægning af blanding inden dråber <ol><li> Cell anerkendelse og kortlægning af blanding inden dråber <ol><li> Brug Escherichia coli Top 10 belastning for levedygtighed analysen eksperiment. Kultur cellerne i Luria-Bertani bouillon natten og matcher den optiske densitet til 0,5 forud for forsøgene. </li><li> Brug 0,4 μM SYTO9 og 1 μM propidium iodid til påvisning af levedygtighed af cellerne. Begge er DNA-intercalating farvestoffer og deres fluorescensintensitet stiger med over 20 folder ved at binde sig til DNA. SYTO9 er et grønt fluorescerende farvestof, der er migmbrane gennemtrængelig og propidium iodid er en rød fluorescerende farvestof, som er membran uigennemtrængelige. Således levende celler fluorescerer &#39;grønne&#39;, mens døde celler udstiller både &#39;grønne&#39; og &#39;røde&#39; emissioner. </li><li> Brug setup indført i 2.2) til grøn / rød fluorescens detektion. </li><li> Brug en bærbar, mini-magnetomrører (Utah Biodiesel Supply, Utah) at røre i cellesuspensioner inden for en 3 ml BD plastipak sprøjte forsynet med en 7mm magnetisk opsigt bar for at forhindre cell sedimentation. </li></ol></li><li> Kortlægning af blanding begivenheder ved hjælp af Flim <ol><li> Fokus den optiske sonde lydstyrken på halvdelen af ​​højden af ​​en mikrokanalplade langs hvilken dråber flyder. </li><li> Form dråber fra to vandige opløsninger (som i figur 3c), der hver indeholder en (ikke-vekselvirkende) fluoroforen med forskellige karakteristiske fluorescerende levetid. </li><li> Begyndende fra den ene side af kanalen, selv foretage hvert forsøg langs hele bredden af ​​kanalen ved 1 μm intervaller. Kanalen edGES let kan identificeres som fluorescensintensitet falder drastisk, når laserstrålen er fokuseret i deres nærhed. </li><li> Implementer en algoritme til at differentiere signal brister (forbundet med dråber) fra støj baggrund af olien fase og at fastlægge varigheden af ​​hvert burst. </li><li> Implementer en anden algoritme til at udtrække de forsinkelse og intensitet værdier langs af hver dråbe ved den særlige bredde, hvor forsøget er udført. 9 </li><li> Brug derefter en maximum likelihood Estimator (MLE) algoritme til at vurdere fluorescensen levetid for hver dråbe i eksperimentet. 8 Gennemsnitsberegnings levetiden værdier for alle dråberne i eksperimentet, reducerer den endelige fejl af MLE beregning (jo flere dråber tastede, at mindre fejl). </li><li> Så snart en menneskealder bane er opnået for hver bredde, kombinere alle de baner i et 2D-kort. Da hver levetid værdi er forbundet med en isærLAR blanding af de to fluorophores, kan en planlagt fusion (eller sammenblanding) kort således være opnået. </li><li> Hvis det ønskes, kan en 3D-kort over dråber blandes let opnås ved at gentage denne protokol i forskellige positioner langs højden af ​​mikrofluid kanal. </li></ol></li></ol> 5. Dataanalyse <ol><li> Nyfortolke rå eksperimentelle data-filer ind i den relevante computing sprog, så de kan analyseres nærmere (fx tekstfiler, der indeholder variationen af ​​foton tæller over tid, kan let pakkes ud Matlab til databehandling og analyse). Du har måske til at skrive specifikke koder for at få adgang til oplysningerne i filer af mere komplekse eksperimenter (såsom dem for Flim), eller for at køre MLE algoritmer eller bygge 2D-kort for at blande mønstre fra livstid baner. </li></ol> 6. Repræsentative resultater Cell anerkendelse Typiske eksempler på variation af foton tæller som en funktion af tiden for den cellebaserede forsøg er vist i figur 4a og c, over en periode på 200 millisekunder. Vigtigt er det Luria-Bertani bouillon (LB medium) fungerer som et svagt fluorescerende baggrund definere vandige dråben grænser, mens forskellige foton brister, svarende til forekomsten af ​​individuelle celler, kan skelnes øverst på denne baggrund. Den LB fluorescerende baggrund er kendetegnet ved en tilnærmelsesvis rektangulært tværsnit (markeret med den røde og grønne stiplede linjer). Den fulde bredde halv maksimum (FWHM) af fluorescerende brister som følge af E. coli-celler er 30-gange kortere end baggrunden dråben begivenheder, som er i overensstemmelse med den relative længde af dråber (40 mikrometer, hvilket svarer til et volumen på 30 picoliter) og E. coli celler (1,5-2,0 mikron). 10 Med dual channel detektereion-system, eksistensen af levende celler eller døde celler kan skelnes fra en analyse af de grønne og røde kanaler. figur 4 b og d viser sandsynlighedsfordelingen beskriver antallet af celler pr dråbe. Kortlægning af blanding begivenheder ved hjælp af Flim Den molekylære fluorescens Levetiden er en iboende egenskab ved en individuel fluoroforen, der kun påvirkes af dets kemiske miljø. Derfor sine målinger kan bruges til at opnå miljøoplysninger (såsom pH, temperatur, polaritet og viskositet) med overlegen opløsning og præcision end tid integreret fluorescens målinger, der er afhængige af eksperimentelle faktorer (såsom koncentration, magnetisering intensitet, og optisk kollektion effektivitet). 9,11 Som det fremgår andetsteds, 8 er det muligt at kortlægge blande mønstre inde i dråber ved hjælp af to fluorophores med different levetid værdier. I en blanding, der indeholder to (non-interaktion) fluorescerende arter henfaldet vil tage på en bieksponentiel form som er vist i ligning 1: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq1.jpg" alt="Ligning 1" /> De enkelte levetider er defineret som τ1 og τ2 og amplituden af ​​hver komponent er givet ved α1 og α2 hhv. Den gennemsnitlige levetid kan derefter defineres som følger: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq2.jpg" alt="Ligning 2" /> Hvor β1 og β2 er andelen af ​​hver enkelt komponent og er defineret som følger: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq3.jpg" alt="Ligning 3" /> Siden sonden volumen er fast og dråber flyder på tværs af den position, en bane af levetiden værdier langs længden af ​​dråber på det pågældende bredde kan således tilvejebringes. Et karakteristisk forløb for en bestemt bredde, Gennemsed blandt 6000 dråber, kan observeres i figur 5a. Ved at kombinere baner i hele bredden af ​​kanalen fører til dannelsen af ​​en 2D-koncentration (eller en blanding) kort. Et typisk resultat er præsenteret i figur 5b. Som gennemsnittet af resultater blandt et stort antal dråber, kan standard fejl af de opnåede resultater blive kraftigt reduceret (1% af standardfejlen med et 95% konfidensinterval for figur 5a). Bestemmelsen metode levetid forløb antager, at alle dråber er stort set identiske. Dette er vist sig at være stort set korrekt af to hovedårsager: hvis dråber var væsentligt anderledes, ville den gennemsnitlige levetid opnåede baner er fladere og mindre divergerende profiler (og skarpe forskelle i levetid på langs af den gennemsnitlige dråber er konsekvent fundet). Desuden er resultaterne er reproducerbare, uanset den enkeltesdråber analyseret eller mængden af dråber, der anvendes i beregningerne. 8 <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Procesflow på mikrofluid chip opspind. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2 a) Diagram der repræsenterer sprøjtepumper og sprøjter, forbundet til mikrofluid chip til dråben formation; b) Skematisk fremstilling af en typisk optisk setup til et to laser - to fluoroforen (grøn og rød) excitation og afsløring.. DC = Dichroic spejl, EM = Emission filter, L = Lens, PH = Pin hul, APD = Avalanche fotodiode detektor. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3 On-chip dråbe formation strategier: a) flow-fokus konfiguration b) T-kryds konfiguration.. c) På chip indkapsling i DRoplets af to oprindeligt adskilte vandige reagenser. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4 Optisk udlæsning på 0,2 s spor registreret for (a) døde, og (c) levende celler (flow for cellesuspension: 1 ml min -1, olie: 2 μl min -1).. Hver bueformede signal svarer til den svagt fluorescerende LB medium, der danner vandige dråben, med dråbe grænser markeret med stiplede linjer. Grøn signaler repræsenterer udlæsning under 633nm og røde signaler over 633 nm bølgelængder. Celler er kendetegnet ved den lodrette spike som følge af DNA intercalating farvestoffer. Sandsynlighedsfordeling for cellulære belægningsprocent inden for en enkelt dråber for (b), døde celler og (d) levende celler. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5 a) Typisk gennemsnit levetid bane langs længden af en dråbe i en bestemt bredde. B)Typisk repræsentation af en kombination af alle de gennemsnitlige baner tastede langs den fulde bredde dråber ind i en 2D levetid (eller koncentration, udtrykt som% FITC /% STR-AF488) kort.

<ol>
	<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li><li>Zheng, B., Angew, I. s. m. a. g. i. l. o. v., F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid/Liquid/Gas+Flow.">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li><li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdroplets:+A+sea+of+applications.">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li><li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems.">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li><li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device.">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+"flow+focusing"+in+microchannels.">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li><li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+&#x03BC;s+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 &#x03BC;s Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li><li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging.">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li><li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics.">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li><li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes.">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li></ol>

Vi har beskrevet fremstillingen af ​​en mikrofluid enhed, en forsøgsopstilling og tilhørende protokoller for microdroplet dannelse og reagens indkapsling og optisk detektion af de forarbejdede dråber. De to eksempler valgt (påvisning af enkeltceller i dråber og kortlægning af blande processer inde flyder små dråber) repræsenterer fælles programmer, der i øjeblikket undersøges med dråbe mikrofluidik. Da de præsenterede forsøgene viser, at brugen af ​​dråben mikrofluid platforme indebære visse attraktive egenskaber, såsom højt throughput, kvasi-perfekte indespærring, høj reproducerbarhed ... Den store mængde fremlagt oplysninger, og den høje hastighed, hvormed denne information bliver genereret, selv om, kræver brug af hurtige påvisningsmetoder med høj Spatiotemporal beslutning, hvis den fulde fordel er at hente fra disse miniaturiserede platforme. I dette tilfælde kan vi påvise, at dette ermuligt ved hjælp af meget præcise fluorescerende spektroskopiske teknikker. Især afslører Flim afsløring teknik (som gør brug af en pulserende laser med gentagelser så kort periode som et par ns) evnen til at få meget hurtige oplysninger fra hurtigt strømmende dråber (omkring 200 pr sekund). I dette tilfælde tidsopløsning af opdagede begivenheder var så lav som 1 mikrosekunder. Med hensyn til grænser i dråbestørrelse og koncentration, ville anvendelsen af ​​større numeriske blænde objektiver og større lasere let, at detektion af nM koncentrationer inden dråber så små som 5 m (begrænsninger i dråbestørrelse blive pålagt af beslutninger fotolitografisk fabrikationsproces og de submicron positionering fase). Mikrofluid dråber er ideelle kandidater til at gennemføre storstilede forsøg med små mængder af reagenser, ned til enkelt mål / begivenhed. Nuværende begrænsninger af denne teknologi indebærer at det er vanskeligt at generere droplets fra en lang række (flere hundrede) af forskellige kilder i en high-throughput måde. Hertil kommer, at det er vanskeligt at målrette og manipulere hvert enkelt genereret dråbe medfører alvorlige begrænsninger for den praktiske anvendelighed af disse teknikker. Derfor er disse spørgsmål er i centrum for vigtige forskning med sigte på at udvikle de nødvendige teknologiske løsninger, der vil gøre det muligt mikrofluid dråben platforme til at blive en standard reference metode til forskning og analyse i high throughput applikationer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Type </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Fluorescein 5-isothiocyanat (FITC) </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidin-Alexa Fluor 488 </td><td> Reagens </td><td> Molecular Probes </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 silikone elastomer kit </td><td> Reagens </td><td> Premier Farnell Storbritannien LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramin-O </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm pulseret diodelaser </td><td> Udstyr </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC Card </td><td> Udstyr </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dichroic spejl </td><td> Udstyr </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Microscope mål </td><td> Udstyr </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Lavine fotodiode </td><td> Udstyr </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidium Iodid </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli top 10-stamme </td><td> Celler </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Udviklingen af ​​mikrofluide platforme for at udføre kemi og biologi har i høj grad været drevet af en række potentielle fordele, der ledsager systemet miniaturisering. Fordele kan nævnes evnen til effektivt at behandle nano-til femoto-liters mængder af prøven, letkøbt integration af funktionelle komponenter, en iboende tilbøjelighed til storstilet multiplexing, forbedrede analytiske kapacitet, bedre kontrol og reduceret instrumentale fodspor. 1 I de senere år stor interesse har fokuseret på udviklingen af dråbe-baserede (eller segmenteret flow) mikrofluid systemer og deres potentiale som platforme i high-throughput eksperimenter. 2-4 Her vand-i-olie emulsioner er lavet til at spontant form mikrofluid kanaler som følge af kapillær ustabilitet mellem de to ikke-blandbare faser. Vigtigt er det, kan microdroplets af præcist definerede mængder og kompositioner blive genereret ved frekvenseraf flere kHz. Desuden kan ved at indkapsle reagenser af interesse inden for isolerede rum er adskilt af en kontinuerlig blandbare fase, både prøve cross-talk og spredning (diffusion-og Taylor-baseret) blive fjernet, hvilket fører til minimal krydskontaminering og evnen til tid analytiske processer med stor nøjagtighed. Derudover, da der ikke er kontakt mellem indholdet af dråber og kanalen vægge (som er vædet med den kontinuerlige fase) absorption og tab af reagenser på den kanal væggene er forhindret. Når dråber af denne art er blevet genereret og behandles, er det nødvendigt at ekstrahere de krævede analytiske oplysninger. I denne henseende påvisningsmetoden af ​​valg bør være hurtig, levere høj følsomhed og lave detektionsgrænser, kunne anvendes til en række molekylære arter, være ikke-destruktiv og være i stand til at blive integreret med mikrofluidenheder på en letkøbt måde. For at imødekomme dette behov har vi udviklet somuite af eksperimentelle værktøjer og protokoller, der gør det muligt for udvinding af store mængder photophysical oplysninger fra små mængder miljøer, og er gældende for analyse af en lang række fysiske, kemiske og biologiske parametre. Heri to eksempler på disse metoder præsenteres og anvendes til påvisning af enkelt celler og kortlægning af blande processer inde picoliter-volumen dråber. Vi indberetter hele eksperimenterende proces herunder mikrofluid chip fabrikation, den optiske opsætning og processen med dråbe generation og detektion.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms at JoVE.com

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Dråbe-baserede mikrofluid platforme er lovende kandidater til high throughput eksperimenter, da de er i stand til at generere picoliter, self-opdelte skibe billigt på kHz priser. Gennem integration med hurtig, følsomme og høj opløsning fluorescens spektroskopiske metoder, kan de store mængder af oplysninger, der genereres inden for disse systemer effektivt udvindes, udnyttes og udnyttes.

Fluorescenspåvisning metoder for mikrofluide dråbe platforme

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modificeret to-foton mikroskop: en ansøgning til sporing af intracellulære vesikler

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Hurtig fluorescensimagografi til molekylær diffusion lov om levende cellemembraner i en kommerciel mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Recovery efter Sammenlægning en Droplet at Mål Todimensional Diffusion af et Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescens Detection for Droplet Microfluidics Brug af optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Fuldt automatiseret Centrifugal mikrofluidanordning for Ultrasensitive Protein Detection fra fuldblod

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trins Variabel Højde Fotolitografi for med ventiler Multilayer mikrofluidenheder

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Sammenlignelige Decellularization af føtale og voksne hjerte væv Explants som 3D-lignende platforme til i Vitro undersøgelser

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...