Name: fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00
Duration: 14 min 16 s
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Die Autoren bedanken sich bei der Unterstützung der folgenden Forschungsräte und Zuschüssen zu bestätigen: EPSRC, HFSP, National Research Foundation of Korea (Grant Number R11-2009-044 bis 1002-0K20904000004-09A050000410).

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	<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li><li>Zheng, B., Angew, I. s. m. a. g. i. l. o. v., F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid/Liquid/Gas+Flow.">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li><li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdroplets:+A+sea+of+applications.">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li><li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems.">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li><li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device.">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+"flow+focusing"+in+microchannels.">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li><li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+&#x03BC;s+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 &#x03BC;s Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li><li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging.">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li><li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics.">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li><li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes.">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li></ol>

Wir haben die Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung, einen Versuchsaufbau und der zugehörigen Protokolle für Mikrotropfen Bildung und Reagenz Verkapselung und optische Detektion der verarbeiteten Tröpfchen beschrieben. Die beiden Beispiele ausgewählt (die Detektion von einzelnen Zellen in Tröpfchen und die Abbildung von Misch-Prozesse innerhalb fließenden Tropfen) stellen gängigen Anwendungen, die derzeit mit Tropfen Mikrofluidik untersucht. Da die vorgestellten Experimente veranschaulichen, präsentieren die Verwendung von Tröpfchen mikrofluidischen Plattformen bestimmte attraktive Eigenschaften, wie hoher Durchsatz, quasi-perfekte Entbindung hohe Reproduzierbarkeit ... Die große Menge an Informationen produziert und die hohe Geschwindigkeit, mit der diese Informationen erzeugt wird, wenn, erfordern den Einsatz von schnellen Nachweisverfahren mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung, wenn die voll ist von diesen miniaturisierte Plattformen gewonnen werden. In diesem Fall zeigen wir, dass diesmöglich mit hochpräzisen fluoreszierenden spektroskopischen Techniken. Insbesondere zeigt die FLIM Nachweisverfahren (was nutzt ein gepulster Laser mit Wiederholung Zeiten so kurz wie ein paar ns) die Fähigkeit, sehr schnell Informationen aus schnell fließenden Tropfen (etwa 200 pro Sekunde) zu erhalten. In diesem Fall ist die zeitliche Auflösung der detektierten Ereignisse war so niedrig wie 1 us. In Bezug auf die Grenzen der Tröpfchengröße und Konzentration wäre die Verwendung von größeren numerischen Apertur Linsen und größere Power-Laser problemlos ermöglichen die Erkennung von nM-Konzentrationen in Tröpfchen so klein wie 5 um (die Grenzen der Tröpfchengröße durch die Beschlüsse der Photolithographie verhängt Herstellungsverfahren und der Submikron Positionierung der Bühne). Mikrofluidiktröpfchen sind ideale Kandidaten für die Durchführung groß angelegter Experimente mit kleinen Mengen an Reagenzien, bis auf einzelne Ziele / event. Aktuelle Grenzen dieser Technologie beinhalten die Schwierigkeit, dr erzeugenoplets aus einer Vielzahl (Dutzende oder Hunderte) von verschiedenen Quellen in einem High-Throughput Weise. Darüber hinaus legt die Schwierigkeit, Ziel-und manipulieren jedes einzelne Tröpfchen erzeugt starke Einschränkungen für die praktische Anwendbarkeit dieser Techniken. Daher sind diese Fragen im Mittelpunkt der wichtigsten Forschungsanstrengungen auf die Entwicklung der notwendigen technologischen Lösungen, die mikrofluidischen Tröpfchen-Plattformen ermöglichen wird, ein Standardwerk Methode der Forschung und Analyse in Anwendungen mit hohem Durchsatz werden soll.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Fluorescein 5-Isothiocyanat (FITC) </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidin-Alexa Fluor 488 </td><td> Reagens </td><td> Molecular Probes </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluordecalin </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit </td><td> Reagens </td><td> Premier Farnell UK LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> Auramin-O </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm gepulsten Diodenlaser </td><td> Ausrüstung </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC Karte </td><td> Ausrüstung </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dichroitischen Spiegel </td><td> Ausrüstung </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Mikroskop-Objektiv </td><td> Ausrüstung </td><td> Olymp </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Avalanche-Photodiode </td><td> Ausrüstung </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli-Stamm Top 10 </td><td> Cells </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Die Entwicklung von mikrofluidischen Plattformen für die Durchführung von Chemie und Biologie hat zum großen Teil durch eine Reihe von potenziellen Vorteile dieses Systems Miniaturisierung begleiten getrieben worden. Die Vorteile umfassen die Fähigkeit, effizient zu bearbeiten nano-to femoto-Liter-Volumen der Probe, einfache Integration von funktionalen Komponenten, eine innere Disposition zur Großanlage Multiplexing, erweiterte analytische Durchsatz, bessere Kontrolle und weniger instrumental Fußspuren. 1 In den letzten Jahren großes Interesse an der Entwicklung der Tropfen-basierten (oder segmentierten Fluss) mikrofluidischen Systemen und ihr Potenzial als Plattformen in High-Throughput-Experimente konzentrieren. 2-4 Hier Wasser-in-Öl-Emulsionen hergestellt werden, spontan in mikrofluidischen Kanälen bilden als Folge der Kapillare Instabilitäten zwischen den beiden nicht mischbaren Phasen. Wichtig ist, dass Mikrotröpfchen von genau definierten Mengen und Zusammensetzungen bei Frequenzen erzeugt werdenvon mehreren kHz. Darüber hinaus durch Kapselung Reagenzien von Interesse innerhalb isolierten Fächern durch eine kontinuierliche mischbaren Phase, die beide Probe cross-talk und Dispersion (Diffusion-und Taylor-based) getrennt beseitigt werden kann, was zu minimalen Kreuzkontamination und die Fähigkeit, die Zeit analytischen Prozesse mit großer Genauigkeit. Zusätzlich wird, da gibt es keinen Kontakt zwischen dem Inhalt der Tröpfchen und die Kanalwände (die durch die kontinuierliche Phase benetzt) ​​Absorption und der Verlust der Reagenzien auf den Kanalwänden wird verhindert. Sobald Tropfen dieser Art erzeugt worden sind und verarbeitet werden, ist es notwendig, die erforderlichen analytischen Informationen zu extrahieren. In dieser Hinsicht ist die Nachweismethode der Wahl sollte schnell sein, eine hohe Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenze, werden für eine Reihe von molekularen Spezies, als nicht-destruktiv und können mit mikrofluidischen Bauteilen in einen einfachen Art und Weise integriert werden. Zu diesem müssen wir als entwickelt haben Adresseuite der experimentellen Werkzeuge und Protokolle, die der Gewinnung von großen Mengen an photophysikalischen Informationen von kleinvolumigen Umgebungen zu ermöglichen, und sind für die Analyse einer Vielzahl von physikalischen, chemischen und biologischen Parametern. Hier zwei Beispiele für diese Methoden werden vorgestellt und angewendet, um die Detektion von einzelnen Zellen und die Abbildung von Misch-Prozesse innerhalb Picoliter-Tröpfchen Volumen. Wir berichten über die gesamte experimentelle Verfahren einschließlich mikrofluidischen Chip-Fertigung, den optischen Aufbau und der Prozess der Tropfen Erzeugung und Detektion.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Droplet-based mikrofluidischen Plattformen sind vielversprechende Kandidaten für einen hohen Durchsatz Experimente, da sie in der Lage, Picoliter, Selbst-compartmentalized Schiffe kostengünstig erzeugen bei kHz Preise sind. Durch die Integration mit schnellen, empfindlichen und hoch aufgelöste Fluoreszenz-spektroskopischen Methoden kann die große Mengen von Informationen in diesen Systemen erzeugt effizient extrahiert werden können, genutzt und verwertet werden.

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