Name: fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke følgende forskningsrådene og stipend: EPSRC, HFSP, National Research Foundation of Korea (Grant Number R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

1. Microchip fabrikasjon <ol><li> SU8 mester fabrikasjon. For å få microfluidic kanaler på 40 mikrometer høyde, spin pels SU8-50 (MicroChem Corp) på en Si wafer ved 3000 rpm i 30 s. Soft bake på en kokeplate ved 65 ° C i 5 minutter og 95 ° C i 30 minutter for å fordampe løsemiddel og fortettes filmen. Etter avkjøling, utsette SU8 motstå med 360-440 nm stråling på 300 MJ / 2 under den aktuelle maske. Etter eksponering, bake wafer ved 65 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 4 minutter. Etter avkjøling, utvikle den ueksponerte områdene (Micrpoposit EC løsemiddel, Chestech) i 5 minutter, med omrøring. 5. Bruk frisk EC løsemiddel å skylle wafer og tørk den under gassen til å generere en ren overflate. Unn wafer med heksan og metanol vasker. Fullfør SU8 mester fabrikasjon prosessen med et siste trinn i fordamper triklor (1,1,2,2-perfluoocytl) silane på overflaten (i en eksikkator i 40 minutter). </li><li> PDMS curing, dicing og hulling. For å danne strukturert microfluidic underlag, bland vi Sylgard 184 (Dow Corning) i en 10:1 (w / w) forholdet mellom harpiks til crosslinker og deretter hell over master. Degas i en eksikkator, og deretter kur enheten (topplaget) for en time ved 65 ° C. Kutt herdet PDMS og skrelle den av master. Lag tilgang hull for fluidic slange ved hjelp av en biopsi punch. Cure et lag av PDMS (8 g av harpiks jevnt fordelt i et 10x10 cm petriskål) i 20 minutter ved 65 ° C. Plasser forberedt øverste laget på bunnen laget og deretter kur over natten ved 65 ° C. Skrell sjetonger fra petriskål og terninger for bruk. </li></ol> 2. Eksperimentelt oppsett <ol><li> Microfluidic setup <ol><li> Fyll sprøyter (plast eller glass fra Beckton, Dickinson and Company eller fra SGE Analytical Science) med nødvendige løsninger, som sikrer ingen luftbobler forbli i noen deler av slangen. For dråpen generasjon to faser brukes. Den vandig (dispergert) PHASe inneholder reagenser av interesse (for eksempel en suspensjon av celler i vekst medium, eller en løsning av molekylære fluorophores). Oljen fasen, som i dette tilfellet fungerer som den kontinuerlige fasen, er som regel dannet av en blanding av olje og surfactant, f.eks 2% Raindance tensidet (Raindance Technologies) i fluorerte olje (3M Fluorinert Electronic Flytende FC-40), eller 2% Span 80 (Croda) i Mineral olje. </li><li> Fit tubing (Polyetylen rør, Harvard Apparatus) av samme indre diameter som sprøytespissen tips om den ene enden til nålene. Slangen bør kuttes til kortest mulig lengde for å minimere flyt ustabiliteter grunnet vibrasjonelle forstyrrelsene. </li><li> Koble den andre enden av slangen direkte til hullene slått i PDMS underlaget. Mer komplekse løsninger, som bruk av silika kapillært porter eller kontakter (f.eks Upchurch Nanoports) kan også gjennomføres for en mer robust grensesnitt mellom microfluidic enheten og slangen. Koble uttaketport av chip til slangen og direkte inn i en samler (for renovasjon eller ytterligere analytten behandling). </li><li> Monter sprøyter på en sprøytepumpe (f.eks PHD 4400 Hpsi programmerbare sprøyte pumper, Harvard Apparatus) og definere den ønskede infusjonen flow-rate for hver fase (vanligvis i størrelsesorden mikroliter per minutt). Et minimum forholdet olje / vandig flow-priser av 1 anbefales å unngå wetting av PDMS av den vandige fasen, noe som ville føre til ustabile dråpe dannelse (avhengig av enheten geometri). Av samme grunn er det også anbefalt å først skylle oljefasen alene, gjennom noen microfluidic kanaler, før innføringen av den vandige fasen. Den endelige oppsettet brukes for forsøkene her er illustrert i figur 2a. </li></ol></li><li> Optisk systemoppsett <ol><li> Å sondere små volumer (ned til noen få picoliters) innenfor microfluidic kanaler med høy romlig og tidsmessig oppløsning bruke en confocal mikroskop (med automated submikron posisjonering kapasitet). </li><li> Bruk vannløselig fluorescerende molekyler med ideelt høy quantum avkastning. Opphisse molekyler ved hjelp av en laser som opererer på en bølgelengde som matcher absorpsjon av fluoroforen involvert. For eksempel kan vanlige fluorescerende molekyler som fluorescein 5-isothiocyanat (FITC) og Alexa-Fluor 488 være effektivt begeistret med en 488 nm diodelaser (f.eks PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485). Fluorescerende molekyler, slik som Texas Red eller Allophycocyanin (APC) kan være effektivt gått ut på 633 nm ved hjelp av en han / Ne laser (f.eks Newport R-31425). </li><li> Bruk pulserende lasere drift ved repetisjon priser på flere MHz (med flere ns puls separasjoner) og fluorophores med tilstrekkelig differensierte levetid egenskaper for fluorescens Lifetime Imaging (flim) eksperimenter. </li><li> Bruk beam-styring speil og optikk for å styre strålen høyde samt bjelke retning. </li><li> Bruk en dichroic speil for å reflektere laserstrålen inn i målet lENS. Hvis to lasere brukes samtidig, kan en dual-band dichroic speilet være installert for å tillate refleksjon av de to laserstråler (f.eks for 488 og 633 nm bjelker en z488/633rdc speil fra Chroma Technology Corporation er ideelt). </li><li> Bruk en uendelig-korrigert, høy numerisk apertur (NA) mikroskop objektiv (dvs. Olympus 60 x / 1,2 NA, nedsenking i vann) for å bringe laserlys til et stramt fokus innenfor et microfluidic kanal. Når du arbeider med høye microchannels (&gt; 100 mikrometer) målet som brukes må være riktig valgt å sikre at dets arbeidsavstand effektivt dekker hele høyden av microchannel. </li><li> Samle fluorescens slippes ut av prøven (innenfor microfluidic kanalen) ved hjelp av samme høye NA objektiv og overføres gjennom samme dichroic speilet. </li><li> Fjern eventuelle gjenværende eksitasjon lys ved hjelp av en enkel eller dual-band utslipp filter (f.eks z488/633 filter fra Chroma Technology Corporation). </li><li> Fokuser fluorescens emission på en 75 mikrometer pinhole hjelp av en plano-konveks linse (f.eks 50,2 F; Newport Ltd). Plasser pinhole i confocal planet av mikroskopet målet. </li><li> Bruk en annen dichroic speil (f.eks 630dcxr, Chroma Technology Corporation) for å splitte fluorescerende signal på to detektorer. </li><li> Filter fluorescens reflekteres av dichroic speilet med et utslipp filter (f.eks en hq540/80 m filter fra Chroma Technology Corporation) og fokuser det med et plano-konveks linse (f.eks f = 30,0, 25,4 id mm, Thorlabs) på den første ( &quot;grønne&quot;) detektor. For forsøk med en sekundær rød fluoroforen filtrere fluorescens overføres av dichroic speilet med et annet utslipp filter (f.eks en hq640lp filter fra Chroma Technology Corporation) og deretter fokusere den med en annen plano-konveks linse på den andre (&#39;red&#39;) detektor. </li><li> Bruk snøskred photodiodes (f.eks AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer) for påvisning av fluorescens fotoner. Den endelige oppsettet er illustrert i <strong&gt; Figur 2b. </li></ol></li></ol> 3. Droplet generasjon og datainnsamling <ol><li> Droplet generasjon metoder <ol><li> Du kan bruke to konfigurasjoner av microchannels å generere dråper: a flow fokus eller T-kryss format (Figur 3a og 3b) 6,7 Begge metodene er likeverdige, så lenge dråpene som dannes er like bred som microchannel selv.. Som et resultat av skjærkrefter som oppstår fra å bruke disse geometrier for å bringe de to blandbare væsker sammen og den påfølgende kapillær ustabiliteter som utvikler seg i grensesnittet, er monodisperse dråper (så små som noen få femtoliters) generert spontant. </li><li> Du kan kapsle reagenser på ulike måter: reagenser kan være forberedt og blandes off chip til den ønskede blandingen / konsentrasjon, eller de kan bringes separat inn i brikken og deretter satt sammen før dråpe dannelse (figur 3c). Dettesiste metoden gir høyere fleksibilitet ettersom blandinger / konsentrasjoner kan endres ved å justere den relative flow-priser. Det bemerkes at for celle innkapsling, bør cellesuspensjonen i sprøyten røres å unngå kondens av cellene over tidsskala av eksperimentet. </li></ol></li><li> Fluorescens datainnsamling. <ol><li> Par det elektroniske signalet fra snøskred fotodiode detektor (beskrevet i 2.2.12) til en multifunksjonsmaskin DAQ enhet for datalogging (f.eks 6602 PCI, National Instruments), kjører på en personlig datamaskin. </li><li> For flim eksperimenter koble detektoren til en Time-Korrelerte Enkelt Photon Counting (TCSPC) kort (for eksempel 100 TimeHarp, PicoQuant GmbH) som kjører på en egen PC. Dette kortet gir mulighet for fluorescens levetid data skal innhentes ved hjelp av en TCSPC metode: hver oppdaget fluorescerende foton er korrelert til en hendelse laser puls, og derfor hver slippes fluorescerende foton er tildelt en forsinkelsestid. Denne datakan monteres til en enkelt eller multi-eksponensiell kurve å få et anslag over fluoroforen / s strålingen hastighet koeffisient / s. Deconvolute rådata med instrumentet respons funksjon (IRF) av detektoren: dette er oppnådd ved bruk av en lav konsentrasjon Auramine-O-løsning (som viser en fluorescens levetid på noen få picoseconds) 8. </li></ol></li></ol> Fire. Cell anerkjennelse og kartlegging av miksing innen dråper <ol><li> Cell anerkjennelse og kartlegging av miksing innen dråper <ol><li> Bruk Escherichia coli Top 10 påkjenning for levedyktigheten analysen forsøket. Kultur cellene i Luria-Bertani kjøttkraft over natten og matche den optiske tettheten til 0,5 før forsøkene. </li><li> Bruk 0,4 mM SYTO9 og 1 mM propidium iodide for registrering av levedyktighet av cellene. Begge er DNA-intercalating fargestoffer og deres fluorescens intensiteten øker med over 20 folder ved binding til DNA. SYTO9 er en grønn fluorescerende fargestoff som er megmbrane gjennomtrengelig og propidium iodide er en rød fluorescerende fargestoff som er membran ugjennomtrengelig. Dermed levende celler fluoresce &quot;grønne&quot; mens døde celler viser både &quot;grønne&quot; og &quot;røde&quot; utslipp. </li><li> Bruk oppsettet introdusert i 2.2) for grønn / rød fluorescens deteksjon. </li><li> Bruk bærbart, mini-magnetrører (Utah Biodiesel Supply, Utah) å røre cellen suspensjoner innen en 3ml BD plastipak sprøyte utstyrt med en 7mm magnetisk røre bar for å hindre celle sedimentering. </li></ol></li><li> Kartlegging av blande hendelser ved hjelp flim <ol><li> Fokuser optisk probe volum til halve høyden på en microchannel langs som dråper flyter. </li><li> Form dråper fra to vandige løsninger (som i figur 3c), som hver inneholder en (ikke-samspill) fluoroforen med ulike karakteristiske fluoriserende levetid. </li><li> Beginning fra den ene siden av kanalen, gjennomføre hvert forsøk langs hele bredden av kanalen på 1 mikrometer mellomrom. Kanalen edtot. lett kan identifiseres som fluorescensintensitet synker drastisk når laserstrålen er fokusert på nærhet deres. </li><li> Implementere en algoritme for å skille signal bursts (assosiert med dråper) fra støyen bakgrunn av olje-fasen og å etablere varigheten av hver burst. </li><li> Implementere et sekund algoritme for å trekke ut forsinkelsestid og intensitet verdier langs lengden av hver dråpe i den konkrete bredde der eksperimentet er utført. 9 </li><li> Deretter bruker du en Maximum Likelihood Estimator (MLE) algoritme for å evaluere fluorescens levetid for hver dråpe i forsøket. Åtte gjennomsnitt levetiden verdier for alle dråpene i forsøket, reduserer den endelige feilen av MLE beregningen (jo mer dråpene probed, den mindre feil). </li><li> Når en levetid bane er oppnådd for hver bredde, kombinere alle baner i et 2D-kart. Siden hver levetid verdi er forbundet med en spesieltLar blanding av de to fluorophores, kan en konsentrasjon (eller blanding) kart derfor innhentes. </li><li> Alternativt kan en 3D-kart over dråpe blande være lett oppnås ved å gjenta denne protokollen i forskjellige posisjoner langs høyden på microfluidic kanalen. </li></ol></li></ol> 5. Dataanalyse <ol><li> Omtolke rå eksperimentelle data filer til riktig databehandling språk slik at de kan bli ytterligere analysert (f.eks tekstfiler som inneholder variasjon av fotonet teller over tid, kan lett pakkes ut Matlab for databearbeiding og analyse). Du må kanskje skrive spesifikke koder for å få tilgang til dataene i filer av mer kompliserte eksperimenter (for eksempel for flim) eller for å kjøre MLE algoritmer eller bygge 2D-kart med å blande patters fra levetid baner. </li></ol> Seks. Representant Resultater Cell anerkjennelse Typiske eksempler på variation av foton teller som en funksjon av tid for celle-baserte forsøk er vist i figur 4a og c, over en periode av to hundre millisekunder. Viktigere den Luria-Bertani kjøttkraft (LB medium) fungerer som et svakt fluoriserende bakgrunn som definerer vandige dråpen grenser, mens distinkte foton bursts, tilsvarende tilstedeværelse av individuelle celler, kan skilles på toppen av denne bakgrunnen. Den LB fluorescerende bakgrunn er preget av en ca rektangulært tverrsnitt (markert med de røde og grønne stiplede linjer). Den fulle bredde en halvdel maksimum (FWHM) av fluorescerende serieopptak som følge av E. coli-celler er 30 ganger kortere enn bakgrunnen dråpen hendelser, som er konsistent med den relative lengden av dråper (40 mikron, tilsvarende et volum på 30 pikoliter) og E. coli celler (1,5 til 2,0 mikron). 10 Med Dual Channel oppdageion system, eksistensen av levende celler eller døde celler kan skilles fra analyse av grønne og røde kanaler. figur 4 b og d viser sannsynlighetsfordelingen beskriver antall celler per dråpe. Kartlegging av blande hendelser ved hjelp flim Den molekylære fluorescens levetid er en iboende egenskap av en individuell fluoroforen som berøres bare av dets kjemiske miljø. Følgelig sin målinger kan benyttes til å innhente miljøinformasjon (som pH, temperatur, polaritet og viskositet) med overlegen oppløsning og presisjon enn tid integrert fluorescens målinger, som er avhengig av eksperimentelle faktorer (slik som konsentrasjon, eksitasjon intensitet, og optiske samling effektivitet). 9,11 Som presentert andre steder, 8 det er mulig å kartlegge blande mønstre inne dråper ved å bruke to fluorophores med different levetid verdier. I en blanding som inneholder to (ikke-vekselvirkende) fluorescerende arter forfallet vil ta en bieksponensiell form som er vist i ligning 1: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq1.jpg" alt="Ligning 1" /> De enkelte levetid er definert som τ1 og τ2, og amplituden til hver komponent er gitt ved α1 og α2 hhv. Den gjennomsnittlige levetid kan da defineres som følger: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq2.jpg" alt="Likning 2" /> Hvor β1 og β2 er brøkdel av hver komponent, og er definert som følger: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq3.jpg" alt="Likning 3" /> Siden sonden volumet er fast og dråper flyter over den posisjonen, verdier en bane av levetiden langs lengden av dråper på det aktuelle bredde kan dermed oppnås. Et kjennetegn banen for en bestemt bredde, averaged blant 6000 dråper, kan observeres i figur 5a. Kombinere baner i hele bredden av kanalen fører til dannelsen av en 2D-konsentrasjon (eller blanding) kart. Et typisk resultat er presentert i figur 5b. Ved gjennomsnitt resultatene blant et stort antall dråper, kan standarden feilen av resultatene oppnådd bli sterkt redusert (1% av standard feil med 95% konfidensintervall for figur 5a). Fastsettelsen Metoden av levetiden bane forutsetter at alle dråpene er praktisk talt identiske. Dette er bevist å være stor grad korrigere for to hovedgrunner: hvis dråper var signifikant annerledes, ville den gjennomsnittlige levetid baner innhentet ha flatere, mindre sprikende profiler (og skarpe forskjeller i levetid langs lengden av gjennomsnitt dråpene er konsekvent oppdages). Videre resultatene er reproduserbare uavhengig av den enkeltesdråper analysert eller mengden av dråper som brukes i beregningene. 8 <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Prosessflyt på microfluidic chip fabrikasjon. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2 a) diagram som representerer sprøyten pumper og sprøyter, koblet til microfluidic chip for dråpe formasjon; b) Skjematisk fremstilling av en typisk optisk oppsett for en to laser - to fluoroforen (grønn og rød) eksitasjon og deteksjon.. DC = dichroic speil, EM = Emission filter, L = Lens, PH = Pin hole, APD = Avalanche fotodiode detektor. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3 On-chip dråpe dannelse strategier: a) flow-fokusering konfigurasjon; b) T-kryss konfigurasjon.. c) På chip innkapsling i DRoplets av to opprinnelig separate vandig reagenser. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4 Optisk avlesning på 0,2 er spor innspilt for (a) død og (c) levende celler (strømningshastigheter for cellesuspensjon: 1 mL min -1, olje: 2 mL min -1).. Hver erke-formet signal tilsvarer svakt fluorescerende LB medium som danner vandige dråpen, med dråpe grenser markert med stiplede linjer. Grønn signaler representerer avlesning henhold 633nm og røde signaler over 633 nm bølgelengder. Cellene er preget av vertikal pigg følger av DNA intercalating fargestoffer. Sannsynlighetsfordelingen for cellulær occupancy innen én dråper for (b) døde celler og (d) levende celler. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5 a) Typisk gjennomsnittlig levetid bane langs en ​​dråpe på en bestemt bredde;. B)Typiske representasjon av kombinasjonen av alle gjennomsnitt baner probed langs hele bredden av dråper inn i en 2D levetid (eller konsentrasjon, uttrykt som% FITC /% Str-AF488) kart.

<ol>
	<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li><li>Zheng, B., Angew, I. s. m. a. g. i. l. o. v., F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid/Liquid/Gas+Flow.">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li><li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdroplets:+A+sea+of+applications.">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li><li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems.">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li><li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device.">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+"flow+focusing"+in+microchannels.">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li><li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+&#x03BC;s+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 &#x03BC;s Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li><li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging.">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li><li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics.">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li><li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes.">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li></ol>

Vi har beskrevet fabrikasjon av en microfluidic enhet, et eksperimentelt oppsett og tilhørende protokoller for microdroplet dannelse og reagens innkapsling og optisk deteksjon av de foredlede dråper. De to eksemplene valgt (påvisning av enkeltceller i dråper og kartlegging av blande prosesser inni flyter dråper) representerer vanlige applikasjoner som for tiden blir undersøkt med dråpe MicroFluidics. Som presentert eksperimenter illustrere, bruk av dråpene microfluidic plattformer på visse attraktive egenskaper, slik som høy gjennomstrømning, kvasi-perfekt innesperring, høy reproduserbarhet ... Den store mengden informasjon som produseres og den høye hastigheten som denne informasjonen blir generert, skjønt, krever bruk av raske deteksjonsmetoder med høy tid og rom oppløsning hvis fulle fordelen er å hente fra disse miniatyrisert plattformer. I dette tilfellet viser vi at dette ermulig ved hjelp av svært presis fluorescerende spektroskopiske teknikker. Spesielt avslører flim påvisning teknikken (som gjør bruk av en pulserende laser med repetisjon perioder så korte som et par ns) kapasitet til å få svært rask informasjon fra raskt rennende dråper (ca 200 per sekund). I dette tilfellet tidsoppløsning over oppdagede hendelser var så lav som 1 μs. I forhold til grenser i dråpestørrelse og konsentrasjon, ville bruk av større numerisk blenderåpning og større makt lasere lett tillater påvisning av nM konsentrasjoner innen blekkdråper så små som 5 mikrometer (begrensningene i dråpestørrelse blir pålagt av vedtak fra fotolitografiske fabrikasjon prosessen og av submikron posisjonering scenen). Microfluidic dråper er ideelle kandidater til å utføre storskala eksperimenter med små mengder av reagenser, ned til single target / event. Nåværende begrensninger av denne teknologien innebærer problemer med å generere droplets fra et stort utvalg (titalls eller hundrevis) av ulike kilder i en high-throughput måte. I tillegg pålegger problemer med å målrette og manipulere hver enkelt dråpe generert store begrensninger for den praktiske anvendelsen av disse teknikkene. Derfor er disse spørsmålene er i sentrum for viktige forskningsinnsats rettet mot å utvikle de nødvendige teknologiske løsninger som vil gjøre microfluidic dråpe plattformer til å bli en standard referanse metode for forskning og analyse i høy gjennomstrømning applikasjoner.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Type </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Fluorescein 5-isothiocyanat (FITC) </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidin-Alexa Fluor 488 </td><td> Reagens </td><td> Molekylære prober </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 silikon elastomer kit </td><td> Reagens </td><td> Premier Farnell Storbritannia LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramine-O </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm pulserende diodelaser </td><td> Utstyr </td><td> PicoQuant </td><td> LD-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC kort </td><td> Utstyr </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dichroic speil </td><td> Utstyr </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Mikroskop objektiv </td><td> Utstyr </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Avalanche fotodiode </td><td> Utstyr </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidium jodid </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli topp 10 påkjenning </td><td> Celler </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Utviklingen av microfluidic plattformer for å utføre kjemi og biologi har i stor grad vært drevet av en rekke potensielle fordeler som følger system miniatyrisering. Fordeler inkluderer muligheten til å effektivt prosess nano-til femoto-liters volum av prøven, lettvinte integrering av funksjonelle komponenter, en iboende predisposition mot storstilt multiplexing, forbedret analytisk gjennomstrømning, bedre kontroll og redusert instrumental fotavtrykk. 1 I de senere år mye interesse har fokusert på utvikling av brann-basert (eller segmentert flow) microfluidic systemer og deres potensial som plattformer i high-throughput eksperimentering. 2-4 Her er vann-i-olje emulsjoner er laget for å spontant form i microfluidic kanaler som følge av kapillære ustabiliteter mellom de to blandbare faser. Viktigere, kan mikrodroppletter av presist definerte volumer og komposisjoner bli generert ved frekvenserav flere kHz. Videre kan ved å innkapsle reagenser av interesse innen isolerte avdelinger atskilt av en kontinuerlig blandbare fase, både sample krysstale og spredning (diffusjon-og Taylor-basert) bli eliminert, noe som fører til minimal krysskontaminering og evnen til annen analytiske prosesser med stor nøyaktighet. I tillegg, siden det ikke er noen kontakt mellom innholdet i dråper og kanalen veggene (som er fuktet av den kontinuerlige fasen) absorpsjon og tap av reagenser på kanalen veggene er forhindret. Når dråper av denne typen har blitt generert og behandlet, er det nødvendig å trekke de nødvendige analytiske informasjonen. I denne forbindelse påvisning metoden for valg bør være rask, gir høy følsomhet og lav påvisningsgrenser være gjeldende for en rekke molekylære arter, være ikke-destruktive og kunne integreres med microfluidic enheter i et lettvinte måte. For å møte dette behovet har vi utviklet somuite av eksperimentelle verktøy og protokoller som gjør det mulig utvinning av store mengder photophysical informasjon fra små volum miljøer, og gjelder for analyse av et bredt spekter av fysiske, kjemiske og biologiske parametre. Heri to eksempler av disse metodene er presentert og brukt til påvisning av enkeltceller og kartlegging av blande prosesser inne picoliter-volum dråper. Vi rapporterer hele eksperimentelle prosessen inkludert microfluidic chip fabrikasjon, den optiske setup og prosessen med dråpe generering og deteksjon.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms at JoVE.com

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Droplet-baserte microfluidic plattformer er lovende kandidater for høy gjennomstrømming eksperimentering siden de er i stand til å generere picoliter, self-compartmentalized fartøy billig på kHz priser. Gjennom integrasjon med rask, følsom og høy oppløsning fluorescens spektroskopiske metoder, kan store mengder informasjon som genereres innenfor disse systemene være effektivt ut, utnyttet og utnyttes.

Fluorescens deteksjon metoder for microfluidic dråpe plattformer

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Recovery etter Flette en Droplet Mål To-dimensjonal Diffusion of et fosfolipid med ett lag

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Helautomatisk Sentrifugal mikrofluid Enhet for Ultra Protein Detection fra Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trinns variabel Høyde Fotolitografi for Valved Multilayer microfluidic enheter

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic Plattform med multiplekset Electronic Detection for Spatial Sporing av partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Sammenlignbare Decellularization av Fetal og voksen hjerte vev Explants som 3D-lignende plattformer for i Vitro studier

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...