Name: fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00
Duration: 14 min 16 s
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Os autores gostariam de agradecer o apoio dos conselhos de investigação e seguintes subsídios: EPSRC, HFSP, National Research Foundation da Coreia (Grant Número R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

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	<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li><li>Zheng, B., Angew, I. s. m. a. g. i. l. o. v., F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid/Liquid/Gas+Flow.">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li><li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdroplets:+A+sea+of+applications.">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li><li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems.">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li><li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device.">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+"flow+focusing"+in+microchannels.">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li><li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+&#x03BC;s+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 &#x03BC;s Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li><li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging.">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li><li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics.">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li><li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes.">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos a fabricação de um dispositivo micro, uma instalação experimental e protocolos associados para a formação microdroplet e encapsulamento de reagentes e de detecção óptica das gotículas processado. Os dois exemplos selecionados (a detecção de células individuais em gotas eo mapeamento de processos de mistura no interior de gotículas de fluxo) representam aplicações comuns que estão sendo investigados com a microfluídica gota. Como os experimentos apresentados ilustram, a utilização de plataformas de gotículas microfluídicos apresentar certas características atraentes, como alta taxa de transferência, quase-perfeito confinamento, alta reprodutibilidade ... A grande quantidade de informação produzida e os de alta velocidade em que a informação está sendo gerada, no entanto, requerem o uso de métodos de detecção rápida com resolução espaço-temporal alta se o proveito é para ser adquirida com essas plataformas miniaturizados. Neste caso, demonstrar que este épossível, utilizando alta precisão fluorescentes técnicas espectroscópicas. Em particular, a técnica de detecção FLIM (que faz uso de um laser pulsado com períodos de repetição tão curto como alguns ns) revela a capacidade de obter informações muito rápido a partir de gotículas de fluir rapidamente (cerca de 200 por segundo). Neste caso, a resolução temporal de eventos detectados foi tão baixa quanto 1 mS. Em termos de limites no tamanho de gota e concentração, o uso de lentes de maior abertura numérica e lasers maior poder seria facilmente permitir a detecção de concentrações nM dentro de gotículas tão pequenas como 5 mm (as limitações no tamanho da gota sendo impostas pelas resoluções da fotolitografia processo de fabricação e do estágio de posicionamento submicron). Gotículas microfluídicos são candidatos ideais para realizar experimentação em larga escala envolvendo pequenas quantidades de reagentes, para baixo para um único alvo / evento. Limitações atuais da tecnologia envolvem a dificuldade de gerar droplets de uma grande variedade (dezenas ou centenas) de diferentes fontes de uma forma de alto rendimento. Além disso, a dificuldade para atacar e manipular cada única gota gerada impõe severas limitações para a aplicabilidade prática destas técnicas. Portanto, estas questões estão no centro dos esforços de investigação importantes destinadas a desenvolver as soluções tecnológicas necessárias que permitirão plataformas gota microfluídicos para tornar-se um método padrão de referência de pesquisa e análise em aplicações de alto rendimento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fluoresceína isotiocianato-5 (FITC) </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Alexa Fluor 488 </td><td> Reagente </td><td> Sondas moleculares </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 kit elastômero de silicone </td><td> Reagente </td><td> Premier Farnell UK LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramina-O </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm pulso de laser de diodo </td><td> Equipamento </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC cartão </td><td> Equipamento </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dichroic espelho </td><td> Equipamento </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Objetiva do microscópio </td><td> Equipamento </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Avalanche fotodiodo </td><td> Equipamento </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Iodeto de propídio </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli estirpe top 10 </td><td> Células </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

O desenvolvimento de plataformas microfluídicos para a realização de química e biologia tem sido em grande parte, impulsionado por uma série de benefícios potenciais que acompanham a miniaturização do sistema. As vantagens incluem a capacidade de processar eficientemente a nano-femoto litros volumes de amostra, a integração fácil de componentes funcionais, uma predisposição intrínseca para a grande escala de multiplexação, throughput analítica avançada, melhor controle e redução pegadas instrumental 1. Nos últimos anos, muito interesse tem-se concentrado no desenvolvimento de gota-based (ou fluxo segmentado) sistemas microfluídicos e seu potencial como plataformas em alto rendimento experimentação. 2-4 Aqui água em óleo emulsões são feitas para formam espontaneamente em canais microfluídicos como resultado de instabilidades capilares entre as duas fases imiscíveis. Importante, microgotas de volumes definidos com precisão e composições podem ser gerados em freqüênciasde vários kHz. Além disso, através do encapsulamento de reagentes de interesse dentro compartimentos isolados separados por uma fase contínua imiscíveis, tanto de amostra cross-talk e de dispersão (difusão e Taylor-based) podem ser eliminados, o que leva a um mínimo a contaminação cruzada ea capacidade de tempo de processos analíticos com grande precisão. Além disso, já que não há contato entre o conteúdo das gotículas e as paredes do canal (que são molhadas pela fase contínua) absorção e perda de reagentes nas paredes do canal é impedida. Uma vez que as gotas deste tipo têm sido geradas e processadas, é necessário para extrair as informações necessárias analítica. Neste contexto, o método de detecção de escolha deve ser rápida, proporcionar alta sensibilidade e limites de detecção baixos, ser aplicável a uma gama de espécies molecular, ser não-destrutiva e ser capaz de ser integrado com dispositivos microfluídicos de uma forma fácil. Para atender a essa necessidade que temos desenvolvido comouite de ferramentas experimentais e protocolos que permitem a extração de grandes quantidades de informação fotofísicas de pequeno volume ambientes, e são aplicáveis ​​à análise de uma ampla gama de parâmetros físicos, químicos e biológicos. Aqui dois exemplos desses métodos são apresentados e aplicados para a detecção de células individuais eo mapeamento de processos de mistura dentro picoliter volume-gotas. Nós relatamos todo o processo experimental, incluindo fabricação de chips microfluídicos, a configuração óptica eo processo de geração de gotas e detecção.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

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