Name: fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00
Duration: 14 min 16 s
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Los autores desean agradecer el apoyo de los consejos de investigación y las subvenciones siguientes: EPSRC, HFSP, Fundación Nacional de Investigación de Corea (número de concesión R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

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	<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li><li>Zheng, B., Angew, I. s. m. a. g. i. l. o. v., F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid/Liquid/Gas+Flow.">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li><li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdroplets:+A+sea+of+applications.">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li><li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems.">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li><li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device.">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+"flow+focusing"+in+microchannels.">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li><li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+&#x03BC;s+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 &#x03BC;s Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li><li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging.">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li><li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics.">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li><li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes.">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li></ol>

Hemos descrito la fabricación de un dispositivo de microfluidos, un montaje experimental y los protocolos asociados para la formación de microgotas y la encapsulación del reactivo y de detección óptica de las gotas de procesado. Los dos ejemplos seleccionados (la detección de células individuales en gotas y el mapeo de los procesos de mezcla dentro de las gotas de fluido) representan las aplicaciones más comunes que se están investigando con la microfluídica gota. Como los experimentos presentados ilustran el uso de plataformas de microfluidos gota presentan ciertas características atractivas, tales como un alto rendimiento, el confinamiento cuasi-perfecta, alta reproducibilidad ... La gran cantidad de información producida y la alta velocidad a la que se proyecta esta información que se genera, sin embargo, requieren el uso de métodos de detección rápida con una resolución espacio-temporal de alta si la ventaja es que se derivan de estas plataformas en miniatura. En este caso se demuestra que esto esposible con alta precisión las técnicas espectroscópicas fluorescentes. En particular, la técnica de detección FLIM (que hace uso de un láser pulsado con períodos de repetición a intervalos de un ns pocos) pone de manifiesto la capacidad de obtener información muy rápidamente a partir de las gotas que fluyen rápidamente (de alrededor de 200 por segundo). En este caso, la resolución temporal de los eventos detectados fue de tan sólo 1 ms. En cuanto a los límites en el tamaño de la gota y la concentración, el uso de lentes de mayor apertura numérica y mayor potencia láser fácilmente permitir la detección de concentraciones nM en gotas tan pequeñas como 5 micras (las limitaciones en el tamaño de la gota impuestas por las resoluciones de la fotolitografía proceso de fabricación y de la etapa de posicionamiento de sub-micras). Gotas de microfluidos son candidatos ideales para llevar a cabo experimentos a gran escala de pequeños importes de los reactivos, hasta un solo objetivo / evento. Las limitaciones actuales de esta tecnología incluyen la dificultad para generar droplets de una gran variedad (decenas o cientos) de distinta procedencia en una forma de alto rendimiento. Además, la dificultad para seleccionar y manipular cada sola gota generada impone severas limitaciones a la aplicación práctica de estas técnicas. Por lo tanto, estos temas están en el centro de importantes esfuerzos de investigación destinados a desarrollar las soluciones tecnológicas necesarias que permitan a las plataformas de microfluidos gota para convertirse en un método estándar de referencia de investigación y análisis de aplicaciones de alto rendimiento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fluoresceína 5-isotiocianato (FITC) </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Alexa Fluor 488 </td><td> Reactivo </td><td> Las sondas moleculares </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalina </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 kit de silicona de elastómero </td><td> Reactivo </td><td> Premier Farnell Reino Unido LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramina-O </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm láser pulsado de diodo </td><td> Equipo </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC tarjeta </td><td> Equipo </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> espejo dicroico </td><td> Equipo </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Microscopio objetivo </td><td> Equipo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Fotodiodo de avalancha </td><td> Equipo </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Yoduro de propidio </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli cepa top 10 </td><td> Las células </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

El desarrollo de plataformas de microfluidos para la realización de la química y la biología ha sido en gran parte impulsado por una serie de beneficios potenciales que acompañan a la miniaturización del sistema. Las ventajas incluyen la capacidad de procesar de manera eficiente a la nano-femoto litros el volumen de la muestra, la integración fácil de los componentes funcionales, una predisposición intrínseca a gran escala de multiplexación, el rendimiento analítico mejorado, un mejor control y reducción de huellas instrumentales 1. En los últimos años un gran interés se ha centrado en el desarrollo de la gota basado (o flujo segmentado) los sistemas de microfluidos y su potencial como plataformas de alto rendimiento de la experimentación. 2-4 Aquí el agua en aceite se hacen para formar de forma espontánea en los canales de microfluidos como resultado de la inestabilidad capilar entre las dos fases inmiscibles. Es importante destacar que las microgotas de volúmenes definidos con precisión y las composiciones se pueden generar en las frecuenciasde varios kHz. Además, mediante la encapsulación de los reactivos de interés dentro de compartimentos estancos separados por una fase continua inmiscible, tanto de la muestra transversal de conversación y de dispersión (difusión y Taylor base) puede ser eliminado, lo que conduce a un mínimo la contaminación cruzada y la capacidad de tiempo de los procesos analíticos con gran precisión. Además, dado que no hay contacto entre el contenido de las gotas y las paredes del canal (que se han humedecido por la fase continua) la absorción y la pérdida de reactivos en las paredes del canal se previene. Una vez que las gotas de este tipo se han generado y procesado, es necesario extraer la información analítica necesaria. En este sentido, el método de detección de elección debe ser rápida, proporciona alta sensibilidad y bajos límites de detección, se aplica a una variedad de especies moleculares, que no destructivo y ser capaz de integrarse con dispositivos de microfluidos de una manera fácil. Para satisfacer esta necesidad hemos desarrollado comouite de herramientas experimentales y protocolos que permiten la extracción de grandes cantidades de información fotofísicos de entornos de pequeño volumen, y son aplicables al análisis de una amplia gama de parámetros físicos, químicos y biológicos. Aquí dos ejemplos de estos métodos se presentan y se aplica a la detección de células individuales y el mapeo de los procesos de mezcla dentro de las gotas de volumen picolitros. Se describe el proceso experimental completo, incluyendo la fabricación de chips de microfluidos, la configuración óptica y el proceso de generación y detección de gota.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

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