Name: fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms at JoVE.com

Författarna vill tacka för det stöd för följande forskningsråd och bidrag: EPSRC, HFSP, National Research Foundation of Korea (licensnummer R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

1. Microchip tillverkning <ol><li> SU8 mästare tillverkning. För att få mikroflödessystem kanaler med 40 ìm höjd, spin rock SU8-50 (MicroChem Corp) på en Si wafer vid 3000 rpm i 30 s. Mjuk baka på en värmeplatta vid 65 ° C i 5 minuter och 95 ° C i 30 minuter för att avdunsta lösningsmedlet och förtäta filmen. Efter nedkylning utsätta SU8 motstånd med 360-440 nm strålning på 300 mJ / 2 under lämplig mask. Efter exponering, baka brödet vid 65 ° C i 2 minuter och 95 ° C i 4 minuter. Efter kylning, utveckla oexponerade områden (Micrpoposit EG lösningsmedel, Chestech) i 5 minuter under omrörning. 5 Använd färska EG lösningsmedel att skölja rånet och sedan torka den i gas för att generera en ren yta. Behandla skivan med hexan och metanol tvättar. Slutför SU8 processen mästare tillverkning med en sista steget i avdunstar triklor (1,1,2,2-perfluoocytl) silan på ytan (i en exsickator i 40 minuter). </li><li> PDMS Curing, tärning och hålslag. Att bilda strukturerat mikroflödessystem substrat, blanda vi Sylgard 184 (Dow Corning) i en 10:1 (w / w) mellan bas och crosslinker och häll sedan över mästaren. Degas i exsickator och sedan bota enheten (översta lagret) i en timme vid 65 ° C. Skär botas PDMS och pilla bort det befälhavaren. Skapa tillgång hål för fluidic slang med en biopsi punch. Cure ytterligare ett lager av PDMS (8 g av den kåda jämnt i en 10x10 cm petriskål) i 20 minuter vid 65 ° C. Placera den förberedda översta lagret på botten lagret och sedan bota natten vid 65 ° C. Skala marker från petriskål och tärna för användning. </li></ol> 2. Experimentuppställning <ol><li> Mikroflödessystem installation <ol><li> Fyll sprutor (plast eller glas från Beckton, Dickinson and Company eller från SGE analytisk vetenskap) med de nödvändiga lösningarna, vilket garanterar några luftbubblor kvar i några delar av slangen. För droppe generation två faser används. Vattenfasen (spridda) PHASe innehåller reagens av intresse (till exempel en suspension av celler i tillväxt medium, eller en lösning av molekylära fluoroforer). Oljan fasen, som i det här fallet fungerar som den kontinuerliga fasen, är i allmänhet består av en blandning av olja och ytaktiva ämnen, t.ex. 2% Raindance tensid (Raindance Technologies) i fluorerade olja (3M Fluorinert Electronic Liquid FC-40), eller 2% Span 80 (Croda) i mineralolja. </li><li> Montera slang (polyeten slang, Harvard Apparatus) av samma innerdiameter som tips injektionsnålen på ett slut på nålar. Slangen bör klippas till kortast möjliga längd för att minimera flödet instabilitet på grund av vibrational störningar. </li><li> Anslut den andra änden av slangen direkt till hål stansade i PDMS underlaget. Mer komplexa lösningar, såsom användning av kvarts kapillär hamnar eller anslutningsdon (t.ex. Upchurch Nanoports) kan också genomföras för ett mer robust gränssnitt mellan mikroflödessystem enheten och slangen. Anslut utloppetporten på chip för att slangen och direkt in i en kollektor (för insamling av avfall eller vidare analyt bearbetning). </li><li> Montera sprutor på en sprutpump (t.ex. PHD 4400 Hpsi programmerbar spruta pumpar, Harvard Apparatus) och ange önskad infusion flöde för varje fas (vanligtvis på order av mikroliter per minut). En minsta andel olja / vatten flödeshastigheter på 1 rekommenderas för att undvika fuktskador på PDMS av vattenfasen, vilket skulle leda till instabila hyalindroppsbildning (beroende på enhetens geometri). Av samma anledning är det också rekommenderat att först spola oljefasen ensam genom någon mikroflödessystem kanaler, innan införandet av vattenfasen. Den slutliga inställning används för experiment här illustreras i figur 2a. </li></ol></li><li> Optisk systeminställningsprogrammet <ol><li> Att söka små volymer (ned till några picoliters) inom mikroflödessystem kanaler med hög spatial och temporal upplösning använder en konfokalmikroskop (med automatED submicron positionering kapacitet). </li><li> Använd vattenlösliga fluorescerande molekyler med perfekt hög quantum avkastning. Excite molekyler med hjälp av en laser som arbetar vid en våglängd som matchar absorption av de inblandade fluoroforen. Till exempel kan vanliga fluorescerande molekyler som fluorescein 5-(FITC) och Alexa-Fluor 488 vara effektivt glada med hjälp av en 488 nm laser diod (t.ex. PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485). Fluorescerande molekyler, såsom Texas Red eller Allophycocyanin (APC) effektivt kan avslutas när 633 nm med en He / Ne laser (t.ex. Newport R-31.425). </li><li> Använd pulsade lasrar som arbetar på upprepning priser på flera MHz (med flera ns puls separationer) och fluoroforer med tillräckligt differentierade livstid egenskaper för fluorescens Lifetime Imaging (Flim) experiment. </li><li> Använd beam-styrning speglar och optik för att styra strålen höjd samt balk riktning. </li><li> Använd en dikroisk spegel att reflektera laserstrålen i målet lENS. Om två lasrar används samtidigt, kan en dual-band dikroiskt spegel monteras så att spegling av två laserstrålar (t.ex. för 488 och 633 nm strålar en z488/633rdc spegel från Chroma Technology Corporation är perfekt). </li><li> Använd en infinity-korrigerade, hög numerisk apertur (NA) mikroskop mål (dvs. Olympus 60 x / 1,2 NA, nedsänkning i vatten) så att laserljus i ett begränsat fokus inom en mikroflödessystem kanal. När du arbetar med höga mikrokanaler (&gt; 100 mikrometer) målet som används måste vara väl utvalda för att säkerställa att dess arbetsavstånd effektivt täcker hela höjden på mikrokanalplatta. </li><li> Samla fluorescens som avges från provet (inom mikroflödessystem kanal) med samma höga NA mål och överförs genom samma dikroiskt spegeln. </li><li> Ta bort eventuella rester av excitation ljus med hjälp av en enkel eller dubbel-band utsläpp filter (t ex en z488/633 filter från Chroma Technology Corporation). </li><li> Fokusera fluorescens emission på en 75 ìm hål med hjälp av en Plano-konvex lins (t.ex. 50,2 F, Newport Ltd). Placera hål i konfokala plan mikroskop målet. </li><li> Använd en annan dikroiskt spegel (t.ex. 630dcxr, Chroma Technology Corporation) att dela upp fluorescerande signal på två detektorer. </li><li> Filtrera fluorescens reflekteras av dikroiskt spegeln med ett utsläpp filter (t.ex. en hq540/80 m filtret från Chroma Technology Corporation) och fokusera den med en Plano-konvex lins (t.ex. f = 30,0, id 25,4 mm, Thorlabs) på den första ( &quot;gröna&quot;) detektor. För försök med en sekundär röd fluoroforen filtrera fluorescens överförs av dikroiskt spegeln med en annan emission filter (t ex en hq640lp filtret från Chroma Technology Corporation) och sedan fokusera det med ett annat plano-konvex lins på den andra (&quot;röd&quot;) detektor. </li><li> Använd lavin fotodioder (t.ex. AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer) för detektion av fluorescens fotoner. Den slutliga inställning illustreras i <strOng&gt; Figur 2b. </li></ol></li></ol> 3. Droplet generation och datainsamling <ol><li> Droplet generationens metoder <ol><li> Du kan använda två konfigurationer av mikrokanaler att generera droppar: ett flöde fokus eller T-korsning format (figur 3a och 3b) 6,7 Båda metoderna är likvärdiga så länge som bildas droppar är lika bred som mikrokanalplatta själv.. Som ett resultat av de skjuvkrafter som uppstår från att använda dessa geometrier att föra de två icke blandbara vätskor tillsammans och den efterföljande kapillära instabiliteter som utvecklas i gränssnittet, är monodisperse droppar (så små som ett par femtoliters) genereras spontant. </li><li> Du kan kapsla in reagens på olika sätt: reagens kan förberedas och blandas ut chip till önskad blandning / koncentration, eller de kan föras separat i chipet och sedan kombineras ihop innan hyalindroppsbildning (figur 3c). Dettasista metoden ger högre flexibilitet eftersom blandningar / koncentrationer kan ändras genom att helt enkelt trimma den relativa flödeshastigheter. Det noteras att för cell inkapsling bör cellsuspensionen i sprutan röras för att undvika kondens av cellerna över tid av experimentet. </li></ol></li><li> Fluorescence datainsamling. <ol><li> Par den elektroniska signalen från lavinen fotodiod detektor (som beskrivs i 2.2.12) till en multifunktionell DAQ enhet för dataloggning (t.ex. en PCI-6602, National Instruments), som körs på en persondator. </li><li> För flim experiment ansluta detektorer till en tidskorrelerade Single Photon Counting (TCSPC) kort (t.ex. TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) som körs på en separat dator. Detta kort gör att fluorescens livstid data som inhämtas med hjälp av en TCSPC metod: varje upptäcks fluorescerande fotonen är korrelerad till en incident laserpuls, och därför var utsända fluorescerande fotonen tilldelas en fördröjning. Denna datakan monteras på en eller flera exponentiellt avtagande kurva för att få en uppskattning av fluoroforen / s radiative hastighet koefficient / s. Deconvolute rådata med instrumentets svar funktionen (IRF) av detektorn: Detta uppnås med hjälp av en låg koncentration Auramine-O-lösning (som uppvisar en fluorescens livstid av ett par pikosekunder) 8. </li></ol></li></ol> 4. Cell erkännande och kartläggning av blandning inom droppar <ol><li> Cell erkännande och kartläggning av blandning inom droppar <ol><li> Använd Escherichia coli Top 10 påfrestningar för lönsamheten analysen experimentet. Kultur cellerna i Luria-Bertani buljong över natten och matcha den optiska densiteten till 0,5 före experiment. </li><li> Använd 0,4 mikroM SYTO9 och 1 mikroM propidiumjodid för att upptäcka livskraften i cellerna. Båda är DNA-intercalating färgämnen och deras fluorescensintensitet ökar med över 20 veck vid bindning till DNA. SYTO9 är en grön fluorescerande färg som är migmbrane genomsläpplig och propidiumjodid är en röd fluorescerande färg som är membranet tätt. Således levande celler fluorescerar &quot;gröna&quot; samtidigt döda celler uppvisar både &quot;gröna&quot; och &quot;röda&quot; utsläpp. </li><li> Använd inställningar infördes 2,2) för grön / röd fluorescens upptäckt. </li><li> Använd en bärbar, mini-magnetomrörare (Utah Biodiesel Supply, Utah) för att röra om i cellsuspensioner inom en 3 ml BD plastipak spruta med en 7mm magnetisk omrörare för att förhindra cell sedimentering. </li></ol></li><li> Kartläggning av blandning evenemang med hjälp flim <ol><li> Fokusera Optical Probe volymen på halva höjden av en mikrokanalplatta längs vilken dropparna rinner. </li><li> Formulär droppar från två vattenlösningar (som i figur 3c), som båda innehåller ett (icke-interagerande) fluoroforen med olika karaktäristiska fluorescerande livstid. </li><li> Början från ena sidan av kanalen, genomföra varje experiment längs hela bredden av kanalen vid 1 ìm mellanrum. Kanalen EDGES lätt kan identifieras som fluorescensintensiteten sjunker drastiskt när laserstrålen är fokuserad i deras närhet. </li><li> Implementera en algoritm för att särskilja signal skurar (i samband med droppar) från bullret bakgrund av oljan fas och för att fastställa varaktigheten för varje burst. </li><li> Implementera en andra algoritm för att extrahera fördröjningstiden och värderingar Ljusstyrkan längs längden på varje droppe i synnerhet bredden där försöket har genomförts. 9 </li><li> Använd sedan en Maximum Likelihood Estimator (MLE) algoritm för att utvärdera fluorescens livstid för varje droppe i försöket. 8 Snittar livstid värden för alla dropparna i försöket, minskar den slutliga felet hos MLE beräkningen (ju fler droppar sonderade den mindre fel). </li><li> När livet bana har erhållits för varje bredd, kombinera alla banor i en 2D-karta. Eftersom varje livstid värde är förenat med en särnande blandning av de två fluoroforer, kan en koncentration (eller blandning) karta därmed erhållas. </li><li> Eventuellt kan en 3D-karta över droppen blanda lätt erhållas genom att upprepa detta protokoll på olika positioner längs höjd mikroflödessystem kanal. </li></ol></li></ol> 5. Dataanalys <ol><li> Omtolka råa experimentella data filerna till lämplig datoranvändning språk så att de kan analyseras ytterligare (t.ex. textfiler som innehåller variationen av fotonen räknas över tiden, lätt kan utvinnas i Matlab för databehandling och analys). Du kanske måste skriva koder för att komma åt uppgifterna i filer av mer komplexa experiment (t.ex. för Flim) eller för att köra MLE algoritmer eller bygga 2D-kartor över blanda mönster från livstid banor. </li></ol> 6. Representativa resultat Cell erkännande Typiska exempel på variation av photon räknas som en funktion av tid för cellbaserade experiment visas i figurerna 4a och c under en period på två hundra millisekunder. Viktigare Luria-Bertani buljong (LB medium) fungerar som ett svagt fluorescerande bakgrund definierar vattenfasen droppe gränser, samtidigt distinkt fotonen spricker, vilket motsvarar förekomsten av enskilda celler, kan urskiljas på toppen av denna bakgrund. LB fluorescerande bakgrunden kännetecknas av en cirka rektangulärt tvärsnitt (märkta med röda och gröna streckade linjer). Hela bredd halv högsta (FWHM) av fluorescerande skurar härrör från E. coli-celler är 30 gånger kortare än de händelser som bakgrund droppe, vilket är förenligt med den relativa längden av droppar (40 mikrometer, vilket motsvarar en volym av 30 pikoliter) och E. coli-celler (1,5 till 2,0 mikrometer). 10 Med dual channel upptäckajon-system, förekomsten av levande celler eller döda celler kan skiljas från analys av de gröna och röda kanaler. show sannolikhetsfördelningen som beskriver antalet celler per droppen figur 4 b och d. Kartläggning av blandning evenemang med hjälp flim Den molekylära fluorescens livstid är en inneboende egenskap hos en individ fluoroforen som påverkas endast av dess kemiska miljö. Därför dess mätningar kan användas för att få miljöinformation (t.ex. pH, temperatur, polaritet och viskositet) med överlägsen upplösning och precision än tid integrerad fluorescensmätningar, som är beroende av experimentella faktorer (såsom koncentration, excitation intensitet och optiska samlingen effektivitet). 9,11 Som framgår på andra håll, 8 är det möjligt att kartlägga blanda mönster inuti droppar med hjälp av två fluoroforer med different livstid värden. I en blandning som innehåller två (ej interagerande) fluorescerande arter förfallet kommer att ta på en biexponentiell form som visas i ekvation 1: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq1.jpg" alt="Ekvation 1" /> De enskilda livslängd definieras som τ1 och τ2, och amplituden av varje komponent ges av α1 och α2 respektive. Den genomsnittliga livslängden kan då definieras enligt följande: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq2.jpg" alt="Ekvation 2" /> När β1 och β2 är andelen av varje komponent och definieras enligt följande: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq3.jpg" alt="Ekvation 3" /> Eftersom sonden volymen är fast och dropparna rinner över den positionen, värderingar en bana i livet längs med dropparna vid just denna bredd kan därmed erhållas. Ett karakteristiskt bollbana för en viss bredd, averagED bland 6000 droppar, kan observeras i figur 5a. Kombinera banor hela bredden på kanalen leder till bildandet av en 2D koncentration (eller blandning) karta. En typisk Resultatet presenteras i figur 5b. Som genomsnittet av de resultaten bland ett stort antal droppar, kan medelfelet för de erhållna resultaten kraftigt reducerad (1% av standardfelet med 95% konfidensintervall för figur 5a). Den metoden för bestämning av livslängden banan förutsätter att alla droppar är praktiskt taget identiska. Detta har visat sig vara i stort sett rätt av två skäl: om dropparna var betydligt annorlunda, skulle den genomsnittliga livslängden erhållas banor har plattare, mindre olika profiler (och skarpa skillnader i livet längs den genomsnittliga droppar är genomgående upptäcks). Dessutom är resultaten reproducerbara oberoende av individuelladroppar analyseras eller mängden droppar som används i beräkningarna. 8 <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Processflöde på mikroflödessystem chip tillverkning. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2 a) diagram som representerar sprutan pumpar och sprutor, ansluten till mikroflödessystem chip för hyalindroppsbildning, b) Schematisk bild av en typisk optisk konfiguration för en två laser - två fluoroforen (grön och röd) excitation och detektion.. DC = dichroic spegel, EM = Emission filter, L = lins, PH = Pin hål, APD = Avalanche fotodiod detektor. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3 On-chip hyalindroppsbildning strategier: a) flödes-fokus konfiguration, b) T-korsning konfiguration.. c) Den chip inkapsling i DRoplets av två ursprungligen separata vattenlösning reagenser. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4 optisk avläsning på 0,2 s spår noterats för (a) döda och (c) levande celler (Flöde för cellsuspension: 1 l min -1, olja: 2 l min -1).. Varje bågformade signal motsvarar svagt fluorescerande LB medium som bildar vatten droppe, med droppe gränser markerade med streckade linjer. Grön signal representerar avläsning i 633nm och röda signaler över 633 nm våglängd. Celler kännetecknas av den vertikala spetsen följd av DNA intercalating färgämnen. Sannolikhetsfördelning för cellulära inflyttning i enstaka droppar för (b) döda celler och (d) levande celler. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5 a) Typisk genomsnittlig livslängd bana längs en ​​droppe vid en viss bredd,. B)Typiska representation av en kombination av alla de genomsnittliga banor sonderade längs hela bredd droppar in i en 2D livstid (eller koncentrationen, uttryckt i% FITC /% STR-AF488) karta.

<ol>
	<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li><li>Zheng, B., Angew, I. s. m. a. g. i. l. o. v., F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid/Liquid/Gas+Flow.">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li><li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdroplets:+A+sea+of+applications.">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li><li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems.">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li><li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device.">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li><li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+dispersions+using+"flow+focusing"+in+microchannels.">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li><li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+&#x03BC;s+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 &#x03BC;s Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li><li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging.">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li><li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics.">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li><li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes.">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li></ol>

Vi har beskrivit tillverkning av en mikroflödessystem enhet, en experimentuppställning och tillhörande protokoll för microdroplet bildning och reagens inkapsling och optisk detektion av de bearbetade droppar. De två exempel som valts (upptäckt av enskilda celler i droppar och kartläggning av blandningen processer inuti flyter droppar) är gemensamma program som för närvarande utreds med droppe mikrofluidik. Då presenteras experiment illustrerar, användning av droppen mikrofabricerade plattformar presentera vissa attraktiva egenskaper, såsom hög genomströmning, kvasi-perfekt förlossning, hög reproducerbarhet ... Den stora mängden information som producerats och den höga hastighet med vilken denna information genereras dock kräver användning av snabba metoder för detektering med hög Spatiotemporal upplösning om hela fördelen är att vinna på dessa miniatyriserade plattformar. I detta fall visar vi att detta ärmöjligt med hjälp av mycket precisa fluorescerande spektroskopiska tekniker. Framför allt avslöjar flim upptäckt teknik (som använder en pulsad laser med upprepning perioderna så korta som ett par NS) har kapacitet att få fram mycket snabbt information från snabbt strömmande droppar (cirka 200 per sekund). I detta fall tidsupplösningen upptäckta händelser var så låg som 1 ìs. När det gäller gränser i droppstorlek och koncentration, skulle användningen av större numerisk bländare och större lasrar makten tillåter lätt att upptäcka nM koncentrationer inom droppar så små som 5 ìm (begränsningarna i droppstorlek införs genom resolutioner fotolitografiska tillverkningsprocessen och submicron positionering scenen). Mikroflödessystem droppar är perfekta kandidater för att utföra storskaliga experiment med små mängder reagens, ner till enda mål / händelse. Aktuella begränsningar av denna teknik innebär att det är svårt att generera droplets från ett stort antal (tiotals eller hundratals) av olika källor i en hög genomströmning sätt. Dessutom ställer det är svårt att rikta och manipulera varje enskild droppe genereras stora begränsningar för den praktiska tillämpningen av dessa tekniker. Därför är dessa frågor är i centrum för viktiga forskning som syftar till att utveckla de nödvändiga tekniska lösningar som gör det möjligt mikroflödessystem droppen plattformar för att bli en standard referensmetod av forskning och analys i hög genomströmning applikationer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Typ </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Fluorescein 5-(FITC) </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidin-Alexa Fluor 488 </td><td> Reagens </td><td> Molekylära sonder </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370.533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 silikonelastomer kit </td><td> Reagens </td><td> Premier Farnell Storbritannien LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramine-O </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861.030 </td></tr><tr><td> 485 nm pulsad diodlaser </td><td> Utrustning </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC kort </td><td> Utrustning </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dichroic spegel </td><td> Utrustning </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Mikroskop mål </td><td> Utrustning </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Avalanche fotodiod </td><td> Utrustning </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidiumjodid </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli topp 10 stam </td><td> Celler </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Utvecklingen av mikrofabricerade plattformar för att utföra kemi och biologi har till stor del drivits av en rad potentiella fördelar som följer med systemet miniatyrisering. Fördelar är förmågan att effektivt bearbeta nano-till femoto-liters volymer av prov, facile integrering av funktionella komponenter, en inneboende anlag mot storskaliga multiplexering, förbättrad analytisk kapacitet, förbättrad kontroll och minskad instrumentala fotspår. 1 På senare år mycket intresse har fokuserat på utveckling av dropp-baserade (eller segmenterade flöde) mikroflödessystem system och deras potential som plattformar i hög genomströmning experiment. 2-4 Här vatten-i-olja emulsioner görs spontant form i mikroflödessystem kanaler som ett resultat av kapillär instabilitet mellan de två icke blandbara. Viktigt kan microdroplets av exakt definierade volymer och kompositioner genereras vid frekvenserav flera kHz. Dessutom kan genom att kapsla in reagenser av intresse inom isolerade fack skiljs åt av en kontinuerlig blandbara fas, både prov överhörning och spridning (diffusion-och Taylor-baserade) elimineras, vilket leder till minimal korskontaminering och förmågan att tiden analytiska processer med stor noggrannhet. Dessutom, eftersom det inte finns någon kontakt mellan innehållet i droppar och väggarna kanal (som fuktats med den kontinuerliga fasen) absorption och förlust av reagenser på kanalen väggar förhindras. När droppar av detta slag har genererats och behandlas, är det nödvändigt att extrahera den önskade analytisk information. I detta avseende metoden för detektion av val bör vara snabb, ger hög känslighet och låg detektionsgräns, kunna tillämpas på en rad molekylära arter, vara icke-förstörande och kunna integreras med mikroflödessystem enheter i ett lättköpt sätt. För att möta detta behov har vi utvecklat somuite av experimentella verktyg och protokoll som möjliggör utvinning av stora mängder fotofysiska information från små volymer miljöer, och gäller för analysen av en rad olika fysikaliska, kemiska och biologiska parametrar. Häri två exempel på dessa metoder presenteras och tillämpas för att upptäcka enskilda celler och kartläggning av blandningen processer inuti pikoliter volym droppar. Vi rapporterar hela experimentella processen inklusive mikroflödessystem chip tillverkning, den optiska setup och processen att droppen generation och upptäckt.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms at JoVE.com

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Droplet-baserade mikroflödessystem plattformar är lovande kandidater för hög genomströmning experiment eftersom de kan generera pikoliter, själv-compartmentalized fartyg billigt till kHz priser. Genom integration med snabba, känsliga och hög upplösning fluorescens spektroskopiska metoder, kan stora mängder information som genereras inom dessa system effektivt extraheras, utnyttjas och används.

Fluorescens detektionsmetoder för mikroflödessystem droppe plattformar

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mikrofabricerade Plattformar för Mekaniskt Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescens Återhämtning efter Sammanfoga en droppe att mäta de tvådimensionella Spridning av en Phospholipid Mono

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Helautomatiska centrifugala mikroflödessystem enhet för Ultraproteindetektion från helblod

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-steg varierande höjd Fotolitografi för Ventilförsedda Multilayer Mikrofluidikanordningar

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikroflödes Plattform med Multiplex elektronisk detektering för rumslig Spårning av partiklar

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Jämförbara Decellularization av Fetal och vuxen hjärtvävnad bladsticklingar som 3D-liknande plattformar för i studier

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...