Name: measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​P20RR018766 en een subsidie ​​van de ABMRF / Stichting voor Alcohol Research.</p

1. Dieren <ol><li> Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Louisiana State University Health Sciences Center en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH publicatie No 85-12, herzien in 1996). Mannelijke Sprague-Dawley ratten (Charles River Laboratories, 270-350 g lichaamsgewicht wt) werden ondergebracht in een gecontroleerde temperatuur (22 ° C) en gecontroleerde verlichting (12:12 h licht donker cyclus) omge...

<ol>
	<li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+system:+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).</li><li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+biology+and+the+microcirculation:+past,+present+and+future.">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li><li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress.">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li><li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels.">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li><li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics.">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li><li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells.">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity.">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li><li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements,+distribution,+and+functions+in+smooth+muscle.">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li><li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity:+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus.">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li><li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II:+modulated+by+G+proteins,+kinases,+and+myosin+phosphatase.">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li><li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication.">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li><li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism.">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li><li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle.">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li><li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaking+through+Ca2++stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization.">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li><li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2++concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation.">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li><li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent.">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li></ol>

Een nieuwe combinatie van methoden is gebruikt om intrinsieke pompen van lymfevaten te bestuderen. De mogelijkheid om gelijktijdig meten van veranderingen in [Ca 2 +] i en diameter in pompen lymfevaten zal zorgen voor studies van de relatieve bijdrage van Ca 2 +-afhankelijke en Ca 2 +-sensibiliserend signaal transductie in de algemene regeling met betrekking tot de lymfatische contractiele cyclus. De lymfatische contractiele cyclus bestaat uit fasi...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Ringer 5x Stock </td></tr><tr><td Chemisch </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Bedragen </td></tr><tr><td> Natrium Chloride </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kalium Chloride </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesium Sulfaat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Steriel gefilterd water </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td> Steriele filter in geautoclaveerd flessen en winkels bij 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. MOPS buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Vennootschap </td&gt; <td> Catalogusnummer </td><td> Bedragen </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Steriel gefilterd water </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td> Steriele filter in geautoclaveerd flessen en winkels bij 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Albumine fysiologische zoutoplossing (APSS) </td></tr><tr><td> Chemisch </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Bedragen </td></tr><tr><td> Ringer voorraad (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Natriumfosfaat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA natrium salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumine, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Steriel gefilterd water </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Breng aan een L </td></tr><tr><td> Breng de pH tot 7,4 bij 37 ° C, dan steriele filter in geautoclaveerd flessen en bewaar bij 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Specifieke reagentia gebruikt. Bewaar alle bij 4 ° C.

measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics

Lymfevaten bevatten een multifunctioneel transport systeem dat vloeistof homeostase onderhoudt, levert lipiden naar de centrale circulatie, en fungeert als een systeem van toezicht voor de potentieel schadelijke antigenen, het optimaliseren van mucosale immuniteit en adaptieve immuunreacties 1. Lymfe is gevormd uit interstitiële vloeistof die blind-ended initiële lymfevaten komt, en dan wordt getransporteerd tegen een druk gradiënt in grotere lymfevaten verzamelen. Elke verzamelen van lymfatische is opgebouwd uit een reeks van segmenten genoemd lymphangions, gescheiden door premolaren kleppen die terugstroming te voorkomen. Elke lymphangion beschikt over een contractiele cyclus die lymfe tegen een druk gradiënt in de richting van de centrale circulatie 2 voortstuwt. Deze fasische contractiele patroon is analoog aan de hartcyclus, met een systolische en diastolische fasen, en met een lagere frequentie krimp 4. Daarnaast, lymfatische gladde spieren genereert toon en displays myogene vernauwing en verwijding in reactie op de stijgingen en dalingen in de luminale druk, respectievelijk 5. Een hybride van moleculaire mechanismen die zowel de fasische en tonische contractiliteit van de lymfevaten te ondersteunen zijn dus voorgesteld. Samentrekking van de gladde spieren in het algemeen bij de cytosolische Ca 2 +-concentratie ([Ca 2 +] i) plus gevoeligheid voor Ca 2 +, van de contractiele elementen in antwoord op veranderingen in de omgeving rondom de cel 6. [Ca 2 +] i wordt bepaald door de combinatie van de beweging van Ca 2 + door middel van plasma membraan ligand of spanningsgevoelige Ca 2 + kanalen en de vrijlating en opname van Ca 2 + uit interne winkels. Cytosolische Ca 2 + bindt aan calmoduline en activeert enzymen zoals myosine lichte keten (MLC) kinase (MLCK), die op zijn beurt fosforyleert MLC leidt tot actine-myosine-gemedieerde contractie 8. Echter, de gevoeligheid van deze weg naar Ca <sup&gt; 2 + kan geregeld worden door de MLC-fosfatase (meerlagenleidingsysteem) 9. MLCP activiteit wordt gereguleerd door Rho kinase (ROCK) en de myosine fosfatase inhibitor proteïne CPI-17. Hier presenteren we een methode om veranderingen te evalueren in [Ca 2 +] i loop van de tijd in geïsoleerde, perfusie lymfatische om Ca 2 +-afhankelijke en Ca 2 +-sensibiliserende mechanismen van lymfatische gladde spiercontractie te bestuderen. Met behulp van geïsoleerde rat mesenteriale het verzamelen van lymfevaten we stretch-geïnduceerde veranderingen bestudeerd in [Ca 2 +] i en contractiele activiteit. De geïsoleerde lymfatische model biedt het voordeel dat de druk, flow, en de chemische samenstelling van het bad oplossing kan strak worden gecontroleerd. [Ca 2 +] i werd bepaald door het laden van lymfevaten met de ratiometrische, Ca 2 +-bindende kleurstof Fura-2. Deze studies zullen een nieuwe benadering van het bredere probleem van het bestuderen van de verschillende moleculaire mechanismen die reguleren fasischcontracties versus tonic vernauwing in lymfatische gladde spieren.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics at JoVE.com

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduceren een benadering van de cytosolische Ca evalueren<sup&gt; 2 +</sup&gt; Concentratie in geïsoleerde lymfevaten te bestuderen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Afhankelijke-en Ca-<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibiliserend mechanismen van lymfatische gladde spiercontractie.

Meting van cytosolische Ca 2 + In geïsoleerde contractiele lymphatische

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Meting van γHV68 infectie in Muizen

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Meting van Tactiele allodynie in een muizenmodel van bacteriële prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Meting van<em&gt; In Vitro</em&gt; Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Meting van de Diameter van de Capsule in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Een methode voor het meten van speekselklier functie in muizen

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...