Name: measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Dette arbeidet ble støttet av NIH gi P20RR018766 og et stipend fra ABMRF / Foundation for Alcohol Research.</p

1. Dyr <ol><li> Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komité ved Louisiana State University Health Sciences Center og ble utført i samsvar med retningslinjene for National Institute of Health (NIH publikasjon nr 85-12, revidert 1996). Mann Sprague-Dawley rotter (Charles River Laboratories, 270-350 g kropp vekt) ble plassert i en kontrollert temperatur (22 ° C) og kontrollert belysning (12:12 h lyse mørke syklus) miljø. Etter ankomst ble rottene sendt til en ukes akklimatiseringsperiode...

<ol>
	<li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+system:+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).</li><li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+biology+and+the+microcirculation:+past,+present+and+future.">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li><li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress.">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li><li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels.">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li><li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics.">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li><li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells.">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity.">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li><li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements,+distribution,+and+functions+in+smooth+muscle.">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li><li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity:+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus.">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li><li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II:+modulated+by+G+proteins,+kinases,+and+myosin+phosphatase.">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li><li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication.">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li><li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism.">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li><li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle.">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li><li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaking+through+Ca2++stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization.">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li><li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2++concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation.">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li><li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent.">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li></ol>

En roman kombinasjon av metoder ble benyttet for å studere iboende pumping av lymfekar. Muligheten til å samtidig måle forandringer i [Ca 2 +] i og diameter i pumping lymfekar vil tillate for studier av relative bidrag av Ca 2 +-avhengige og Ca 2 +-sensibiliserende signalveier i den generelle mekanismen som styrer lymfatiske kontraktile syklus. Det lymfatiske kontraktile syklus består av phasic sammentrekninger oppå tone. Dataene viser at hver...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Ringer 5x Stock </td></tr><tr><td Kjemisk </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Kalsiumklorid </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesium Sulfate </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Sterile Filtrert Vann </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td> Sterile filteret inn autoklaveres flasker og lagrer ved 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. Mopper buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td> Firma </td&gt; <td> Catalog Number </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Mopper </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Sterile Filtrert Vann </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td> Sterile filteret inn autoklaveres flasker og lagrer ved 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Albumin Fysiologiske Salt Solution (APSS) </td></tr><tr><td> Kjemisk </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Ringer lager (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mopper Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Natriumfosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Sodium Pyruvat </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA natrium salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0.0074 g </td></tr><tr><td> Glukose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumin, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Sterile Filtrert Vann </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring til 1 L </td></tr><tr><td> Juster pH til 7,4 ved 37 ° C, deretter sterile filteret inn autoklaveres flasker og oppbevar ved 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Spesifikke reagenser Used. Oppbevar alle ved 4 ° C.

measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics

Lymfekar utgjør et multifunksjonelt transport system som opprettholder væske homeostase, leverer lipider til den sentrale sirkulasjon, og fungerer som et overvåkingssystem for potensielt skadelige antigener, optimalisere mucosal immunitet og adaptive immunresponser 1. Lymfe er dannet fra interstitiell væske som kommer blind-ended innledende lymfekjertlene, og deretter transporteres mot en trykkgradient i større samle lymfekar. Hver samle lymfatisk består av en rekke segmenter som kalles lymphangions, atskilt av bicuspid ventiler som hindrer tilbakestrømning. Hver lymphangion besitter en kontraktile syklus som driver lymph mot en trykkgradient mot den sentrale sirkulasjon 2. Dette phasic kontraktile mønsteret er analogt til hjerte-syklus, med systolisk og diastolisk faser, og med en lavere sammentrekning frekvens fire. I tillegg genererer lymphatic glatt muskel tone og viser myogenic innsnevring og utvidelse in respons på økning og reduksjon i luminal press, henholdsvis 5. En hybrid av molekylære mekanismer som støtter både phasic og tonic kontraktilitet av lymfekjertlene er dermed foreslått. Sammentrekning av glatt muskulatur er generelt regulert av cytosoliske Ca 2 + konsentrasjon ([Ca 2 +] i) pluss sensitivitet til Ca 2 +, av kontraktile elementer i respons til endringer i miljøet som omgir cellen 6. [Ca 2 +] i er bestemt av kombinasjonen av bevegelsen av Ca 2 + gjennom plasmamembranen ligand eller spenning gated Ca 2 + kanaler og frigjøring og opptak av Ca 2 + fra interne butikker. Cytosoliske Ca 2 + binder seg til calmodulin og aktiverer enzymer som myosin lett kjede (MLC) kinase (MLCK), som igjen phosphorylates MLC fører til actin-myosin-mediert kontraksjon 8. Men følsomheten av denne veien til Ca <sup&gt; 2 + kan reguleres av MLC fosfatase (MLCP) 9. MLCP aktiviteten er regulert av Rho kinase (ROCK) og myosin fosfatase inhibitor protein KPI-17. Her presenterer vi en metode for å vurdere endringer i [Ca 2 +] i over tid i isolerte, perfused lymfekjertlene for å studere Ca 2 +-avhengige og Ca 2 +-sensibiliserende mekanismer av lymfatisk glatt muskel sammentrekning. Bruk isolerte rotte mesenteric samle lymfekar vi studert stretch-indusert forandringer i [Ca 2 +] i og kontraktil aktivitet. Den isolerte lymfatiske Modellen har den fordelen at trykk, flow, og den kjemiske sammensetningen av badekaret løsningen kan være strengt kontrollert. [Ca 2 +] i ble bestemt ved lasting lymfekar med ratiometric, 2 Ca +-bindende dye Fura-2. Disse studiene vil gi en ny tilnærming til bredere problemet med å studere de forskjellige molekylære mekanismer som regulerer phasicsammentrekninger versus tonic innsnevring i lymfatisk glatt muskulatur.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics at JoVE.com

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Vi introduserer en tilnærming for å evaluere cytosoliske Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Konsentrasjon i isolerte lymfekar å studere Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Avhengige og Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Sensibiliserende mekanismer av lymfatisk glatt muskel sammentrekning.

Måling av cytosoliske Ca 2 + I isolerte kontraktile lymfesystem

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Måling av γHV68 Infeksjon i Mus

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Måling av antistoffer Effekter på cellulær funksjon av isolerte cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Ex Vivo røde blodceller Hemolyse Assay for Evaluering av pH-responsive Endosomolytic Agenter for cytosoliske Levering av Biomacromolecular narkotika

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifisering av cytosolisk vs. vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primær Makrofager av Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

måling av<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrering Aktivitet av HIV-1 Preintegration Komplekser

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Måling av kapselen Diameter i Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metode for måling av Salivary kjortelen funksjon i mus

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...