Name: measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00
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<p class="jove_content"&gt; Este trabalho foi financiado pelo NIH e P20RR018766 conceder uma subvenção do ABMRF / Fundação para a Pesquisa do Álcool.</p

1. Animais <ol><li> Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Louisiana State University Health Sciences Center e foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH publicação 85-12 No., revista em 1996). Masculino Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de corpo wt) foram alojados em uma temperatura controlada (22 ° C) e iluminação controlada (12:12 h ciclo de luz escuro) ambiente. Após a chegada, os ratos foram submeti...

<ol>
	<li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+system:+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).</li><li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+biology+and+the+microcirculation:+past,+present+and+future.">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li><li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress.">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li><li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels.">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li><li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics.">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li><li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells.">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity.">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li><li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements,+distribution,+and+functions+in+smooth+muscle.">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li><li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity:+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus.">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li><li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II:+modulated+by+G+proteins,+kinases,+and+myosin+phosphatase.">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li><li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication.">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li><li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism.">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li><li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle.">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li><li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaking+through+Ca2++stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization.">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li><li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2++concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation.">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li><li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent.">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li></ol>

A nova combinação de métodos foi empregado para estudar intrínseca de bombeamento dos vasos linfáticos. A capacidade de medir simultaneamente mudanças na [Ca 2 +] i e diâmetro no sistema linfático de bombeamento permitirá estudos sobre as contribuições relativas de Ca 2 +-dependente e Ca 2 +-sensibilizantes vias de sinalização em todo o mecanismo que rege o ciclo linfática contrátil. O ciclo contrátil linfática consiste em contraç...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Ringer stock 5x </td></tr><tr><td Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. Tampão MOPS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Solução Sal albumina Physiological (APSS) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Ringer estoque (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> Tampão Mops </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA de sódio salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumina Bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td> Ajustar o pH para 7,4 a 37 ° C, seguida de filtração estéril em frascos autoclavados e armazenar a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos utilizados. Armazenar todos a 4 ° C.

measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics

Vasos linfáticos formam um sistema de transporte multifuncional que mantém a homeostase dos fluidos, oferece lípidos para a circulação central, e atua como um sistema de vigilância para os antígenos potencialmente prejudiciais, otimizando a imunidade da mucosa e respostas imunes adaptativas 1. A linfa é formado a partir de líquido intersticial que entra cego-ended linfáticos iniciais, e depois é transportado contra um gradiente de pressão na maior sistema linfático coleta. Cada linfáticos é composta de uma série de segmentos chamados lymphangions, separados por válvulas bicúspide, que impedem o refluxo. Cada lymphangion possui um ciclo de contração que impulsiona linfáticos contra um gradiente de pressão para a circulação central 2. Este padrão contrátil fásica é análogo ao do ciclo cardíaco, com fases sistólica e diastólica, e com menor freqüência 4 contração. Além disso, o músculo liso linfático gera tom e exibe miogênica constrição e dilatação in resposta a aumentos e diminuições na pressão luminal, respectivamente 5. Um híbrido de mecanismos moleculares que suportam tanto a contratilidade fásicas e tônicas dos vasos linfáticos são assim propostas. Contração do músculo liso é geralmente regulado pelo Ca 2 + citosólico concentração ([Ca 2 +] i) a sensibilidade de mais para Ca 2 +, dos elementos contrátil em resposta a mudanças no ambiente ao redor da célula 6. [Ca 2 +] i é determinado pela combinação do movimento do Ca 2 + através da membrana plasmática ligante ou tensão gated Ca 2 + e canais a liberação e absorção de Ca 2 + das lojas internas. Citosólica de Ca 2 + se liga a calmodulina e ativa enzimas como a cadeia leve de miosina (MLC) quinase (MLCK), que por sua vez fosforila MLC levando a actina-miosina-contração mediada 8. No entanto, a sensibilidade desta via de Ca <sup&gt; 2 + pode ser regulada pela fosfatase MLC (MLCP) 9. MLCP atividade é regulada por Rho quinase (Rock) e da proteína miosina inibidor da fosfatase CPI-17. Aqui, apresentamos um método para avaliar as alterações na [Ca 2 +] i ao longo do tempo isolado, vasos linfáticos perfundidos para estudar Ca 2 +-dependente e Ca 2 +-sensibilizar os mecanismos de contração do músculo liso linfático. Usando linfáticos mesentéricos isolados de ratos coletando estudamos estiramento induzido por mudanças na [Ca 2 +] i e atividade contrátil. O modelo linfático isolado oferece a vantagem de pressão, fluxo e da composição química da solução de banho podem ser bem controladas. [Ca 2 +] i foi determinado pela carga linfáticos com o raciométrica, Ca 2 +-binding corante Fura-2. Estes estudos fornecem uma nova abordagem ao problema mais amplo de estudar os diferentes mecanismos moleculares que regulam fásicacontrações contra constrição tônica no músculo liso linfático.

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Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Nós introduzimos uma abordagem para avaliar o Ca citosólico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Concentração no sistema linfático isolado para estudar Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dependente e Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibilizante mecanismos de contração do músculo liso linfático.

Medição do Ca citosólico 2 + Em Isolated linfáticos contráteis

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Medição de γHV68 Infecção em Camundongos

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Imunologia e Infecção

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Medição dos Efeitos de anticorpos sobre a função celular de cardiomiócitos isolados

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Medição da alodinia táctil em um modelo murino de prostatite bacteriana

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

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Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

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Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

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Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

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Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

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