Name: measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00
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<p class="jove_content"&gt; Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención P20RR018766 y una subvención de la ABMRF / Fundación para la Investigación del Alcohol.</p

1. Los animales <ol><li> Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Louisiana State University Health Sciences Center, y se realizaron de acuerdo con las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH publicación N º 85-12, revisada en 1996). Las ratas macho Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de peso corporal) fueron alojados en una temperatura controlada (22 ° C) y la iluminación controlada (12:12 h ciclo de luz oscuridad) medio ambien...

<ol>
	<li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+system:+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).</li><li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+biology+and+the+microcirculation:+past,+present+and+future.">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li><li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress.">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li><li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels.">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li><li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics.">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li><li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells.">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity.">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li><li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements,+distribution,+and+functions+in+smooth+muscle.">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li><li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity:+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus.">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li><li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II:+modulated+by+G+proteins,+kinases,+and+myosin+phosphatase.">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li><li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication.">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li><li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism.">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li><li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle.">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li><li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaking+through+Ca2++stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization.">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li><li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2++concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation.">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li><li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent.">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li></ol>

Una nueva combinación de métodos se emplean para el estudio intrínseco de bombeo de los vasos linfáticos. La capacidad de medir simultáneamente los cambios en la [Ca 2 +] i y el diámetro de los vasos linfáticos de bombeo permitirá que para el estudio de las contribuciones relativas de Ca 2 +-dependiente y Ca 2 +-sensibilizar a las vías de señalización en el mecanismo general que rigen el ciclo de contracción linfático. El ciclo de cont...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Ringer 5x de archivo </td></tr><tr><td Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfato de magnesio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. MOPS buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Solución de albúmina salina fisiológica (APSS) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Timbre de valores (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Trapeadores Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> El piruvato de sodio </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA de sodio salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albúmina, bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td> Ajustar el pH de 7,4 a 37 ° C, luego de filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos utilizados. Almacene todos a 4 ° C.

measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics

Los vasos linfáticos forman un sistema de transporte multifuncional que mantiene la homeostasis de fluidos, proporciona los lípidos de la circulación central, y actúa como un sistema de vigilancia para los antígenos potencialmente peligrosos, la optimización de inmunidad de la mucosa y la respuesta inmune adaptativa 1. Linfático está formado por el líquido intersticial que entra ciegos composición linfáticos iniciales, y luego se transporta en contra de un gradiente de presión en los vasos linfáticos más grandes de recolección. Cada linfático recolección se compone de una serie de segmentos llamados linfangiones, separados por válvulas bicúspides que evitar el reflujo. Cada lymphangion posee un ciclo de contracción que impulsa la linfa en contra de un gradiente de presión hacia la circulación central 2. Este patrón de contracción fásica es análoga a la del ciclo cardíaco, con fases sistólica y diastólica, y con una contracción del 4 de baja frecuencia. Además, el músculo liso linfático genera tono y muestra la constricción y la dilatación miogénica in respuesta a los aumentos y disminuciones en la presión luminal, respectivamente 5. Un híbrido de los mecanismos moleculares que apoyan tanto la contractilidad fásica y tónica de los linfáticos Así, se proponen. Contracción del músculo liso está regulada por la citosólica de Ca 2 + de concentración ([Ca 2 +] i), además de la sensibilidad a Ca 2 +, de los elementos contráctiles en respuesta a cambios en el entorno que rodea la célula 6. [Ca 2 +] i se determina por la combinación del movimiento de la Ca 2 + a través de la membrana plasmática del ligando o voltaje de Ca2 + y los canales de la liberación y absorción de Ca 2 + en las tiendas internas. Citosólica de Ca 2 + se une a la calmodulina y activa las enzimas tales como la cadena ligera de la miosina (MLC) quinasa (MLCK), que a su vez fosforila MLC que conduce a la actina-miosina mediada por la contracción 8. Sin embargo, la sensibilidad de esta vía a Ca <sup&gt; 2 + puede ser regulada por la fosfatasa MLC (PCML) 9. PCML actividad está regulada por la Rho quinasa (ROCK) y la fosfatasa miosina inhibidor de la proteína CPI-17. A continuación, presentamos un método para evaluar los cambios en la [Ca 2 +] i en el tiempo en los vasos linfáticos aislados, perfundidos con el fin de estudiar Ca 2 +-dependiente y Ca 2 +-sensibilizar a los mecanismos de contracción del músculo liso linfático. El uso aislado linfáticos mesentéricos de ratas se estudió la recogida estirar los cambios inducidos en el [Ca 2 +] i y la actividad contráctil. El modelo linfático aislado ofrece la ventaja de que la presión, el flujo y la composición química de la solución del baño puede ser muy controlado. [Ca 2 +] i fue determinada por la carga de vasos linfáticos con el radiométrica, Ca 2 +-unión del colorante Fura-2. Estos estudios proporcionan un nuevo enfoque al problema más amplio de estudio de los diferentes mecanismos moleculares que regulan fásicacontracciones tónico contra la constricción del músculo liso linfático.

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Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Se introduce un enfoque para evaluar la citosólica de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Concentración en los vasos linfáticos aislados para estudiar Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dependiente y Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibilizante mecanismos de contracción del músculo liso linfático.

Medición de la citosólica de Ca 2 + En aislados linfáticos contráctil

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

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La medición de γHV68 infección en los ratones

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Medición de los efectos de anticuerpos en la función celular de cardiomiocitos aislados

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

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Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Medida de la alodinia táctil en un modelo murino de la prostatitis bacteriana

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

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Ex Vivo Blood Red Cell Hemólisis Ensayo para la Evaluación de pH sensibles a agentes endosomolítico para la entrega citosólica de Drogas biomacromoleculares

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

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Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

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Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

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