Name: measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Detta arbete stöddes av NIH bidrag P20RR018766 och ett bidrag från ABMRF / Stiftelsen för alkoholforskning.</p

1. Djur <ol><li> Alla förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och använda kommittén vid Louisiana State University Health Sciences Center och utfördes i enlighet med riktlinjerna för National Institute of Health (NIH publikation nr 85-12, reviderad 1996). Man Sprague-Dawley råttor (Charles River Laboratories, 270-350 g kroppen wt) var inrymt i en kontrollerad temperatur (22 ° C) och kontrollerad belysning (00:12 h ljus mörker-cykel) miljö. Efter ankomsten var råttorna in till en veckas acklima...

<ol>
	<li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+system:+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation.">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).</li><li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+biology+and+the+microcirculation:+past,+present+and+future.">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li><li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress.">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li><li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels.">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li><li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics.">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li><li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells.">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity.">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li><li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements,+distribution,+and+functions+in+smooth+muscle.">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li><li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity:+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus.">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li><li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II:+modulated+by+G+proteins,+kinases,+and+myosin+phosphatase.">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li><li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication.">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li><li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism.">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li><li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle.">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li><li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaking+through+Ca2++stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization.">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li><li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2++concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation.">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li><li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent.">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li></ol>

En ny kombination av metoder som var anställd för att studera inneboende pumpning av lymfkärl. Förmågan att samtidigt mäta förändringar i [Ca2 +] i och diameter i pumpning lymfkärlen kommer att möjliggöra studier av relativa bidrag Ca2 +-beroende och Ca 2 +-allergiframkallande signalvägar i den övergripande mekanism som styr det lymfatiska kontraktila cykeln. Den lymfatiska kontraktila cykeln består av phasic sammandragningar ovanpå ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Ringer 5x Stock </td></tr><tr><td Kemisk </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Belopp </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Kalciumklorid </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Sterila filtrerat vatten </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td> Sterila filtret i autoklaveras flaskor och butiker vid 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. MOPS buffert </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Företag </td&gt; <td> Katalognummer </td><td> Belopp </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Sterila filtrerat vatten </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td> Sterila filtret i autoklaveras flaskor och butiker vid 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Albumin Fysiologisk saltlösning (APSS) </td></tr><tr><td> Kemisk </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Belopp </td></tr><tr><td> Ringer lager (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Natriumfosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Natrium Pyruvat </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA natrium salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glukos </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumin, Bovin </td><td> USB </td><td> 10.856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Sterila filtrerat vatten </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ta till 1 L </td></tr><tr><td> Justera pH till 7,4 vid 37 ° C, därefter sterila filtret i autoklaveras flaskor och förvara vid 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Specifika reagenser som används. Förvara alla vid 4 ° C.

measurement of cytosolic ca2+ in isolated contractile lymphatics

Lymfkärl består av ett multifunktionellt transportsystem som håller vätska homeostas, levererar lipider till den centrala cirkulationen, och fungerar som ett övervakningssystem för potentiellt skadliga antigener, optimera slemhinnor immunitet och adaptiva immunsvaret 1. Lymfan bildas från interstitiell vätska som kommer in döda slutade initiala lymfkärlen, och sedan transporteras mot en tryckgradient i större samla lymfkärlen. Varje samla lymfatiska består av en serie segment som kallas lymphangions, separerade med bicuspid ventiler som hindrar återflöde. Varje lymphangion besitter en kontraktila cykel som driver lymfan mot en tryckgradient mot de centrala cirkulationen 2. Detta phasic kontraktila mönster är analogt med hjärt-cykel med systoliskt och diastoliskt faser, och med en lägre kontraktion frekvens 4. Dessutom genererar lymfatisk tonus i glatt och visar myogenic sammandragning och utvidgning in svar på ökningar och minskningar i luminala tryck, respektive 5. En hybrid av molekylära mekanismer som stödjer både phasic och tonic kontraktilitet av lymfkärlen är därmed föreslås. Sammandragning av glatt muskulatur i allmänhet regleras av cytosoliskt Ca 2 + koncentration ([Ca 2 +] i) plus känslighet för Ca 2 +, av kontraktila element som svar på förändringar i miljön som omger cellen 6. [Ca 2 +] i är bestäms av kombinationen av rörelse Ca 2 + genom plasmamembranet ligand eller spänningsstyrda Ca 2 +-kanaler och utsläpp och upptag av Ca 2 + från interna butiker. Cytosoliskt Ca 2 + binder till calmodulin och aktiverar enzymer som myosin lätt kedja (MLC) kinas (MLCK), som i sin tur fosforylerar MLC leder till aktin-myosin-medierad kontraktion 8. Men känsligheten för denna väg till Ca <sup&gt; 2 + kan regleras av MLC-fosfatas (MLCP) 9. MLCP verksamhet är reglerad av Rho-kinas (ROCK) och myosin fosfatas hämmare protein KPI-17. Här presenterar vi en metod för att utvärdera förändringar i [Ca2 +] i tiden i isolerade, perfusion lymphatics för att studera Ca2 +-beroende och Ca 2 +-allergiframkallande mekanismer lymfatisk glatt muskulatur kontraktion. Använda isolerade råtta mesenteriska samla lymfkärlen vi studerade sträck-inducerade förändringar i [Ca2 +] i och kontraktila aktiviteten. De isolerade lymfatiska modellen har den fördelen att tryck, flöde och den kemiska sammansättningen av badet lösningen hårt kan kontrolleras. [Ca 2 +] Jag var fast besluten genom att ladda lymfkärlen med ratiometrisk, Ca2 +-bindande dye Fura-2. Dessa studier kommer att ge en ny syn på det bredare problemet med att studera olika molekylära mekanismer som reglerar phasicsammandragningar kontra tonic sammandragning i lymfatisk glatt muskulatur.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics at JoVE.com

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Vi presenterar en metod för att utvärdera cytosoliska Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Koncentration i enstaka lymfkärlen att studera Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Beroende och Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Allergiframkallande mekanismer lymfatisk glatt muskulatur kontraktion.

Mätning av cytosoliska Ca 2 + I enstaka kontraktila lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Mätning av γHV68 infektion hos möss

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Mätning av antikropp Effekter på cellulär funktion av isolerade hjärtmuskelceller

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kvantitativ mätning av immunsvaret och sova i<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Mätning av taktil allodyni i en murin modell av bakteriell prostatit

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Ex vivo röda blodkroppar Hemolys analys för utvärdering av pH-responsiva Endosomolytic ombud för cytosoliskt Leverans av Biomacromolecular Droger

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifiering av cytosoliska vs. vakuolär<em&gt; Salmonella</em&gt; I primära makrofager genom Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

mätning av<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivitet av HIV-1 Preintegration Anläggningar

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Mätning av kapsel Diameter i Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metod för mätning av Saliv-körtel funktion hos möss

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...