Name: murine superficial lymph node surgery
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00
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Agradecemos Sylvie Lesage e todos os membros do laboratório para a leitura crítica do protocolo. Este trabalho foi financiado por uma subvenção (MOP-77545) do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque é apoiado por uma bolsa de estudos FRSQ Sênior e Mélissa Mathieu recebeu um NSERC Alexander Graham Bell Canada Bolsa de Pós-Graduação.

1. Preparação antes da cirurgia Os ratos foram tratados de acordo com o Conselho Canadense sobre as orientações de cuidados com animais. <ol><li> Ratinhos anestesiar por injecção de cetamina / xilazina (150/300 mg / kg, ip) ou por inalação de isoflurano (2%, oxigénio 1L). Se estiver disponível, isoflurano deve ser utilizado, pois permite um melhor controlo da anestesia tempo e profundidade. Além disso, o oxigénio é administrado ao mesmo tempo que suporta as funções fisiológ...

<ol>
	<li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen.">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li><li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience.">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li><li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8(+)+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1.">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li><li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes.">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li><li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses.">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li><li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-controllable+selection+of+CD4(+)+T+cells:+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules.">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li><li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+much+TCR+does+a+T+cell+need.">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li><li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+density+influences+CD8++memory+T+cell+differentiation.">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740 (2010).</li><li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression.">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li><li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4(+)+T+cell+response.">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li><li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells.">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li><li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8++memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization.">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li><li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8++T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation.">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li></ol>

Nós descrevemos um protocolo de cirurgia LN que pode ser aplicado a muitos sistemas experimentais. Embora muito útil para acompanhar as respostas imunes ou homeostase de células imunes, esta técnica tem algumas limitações. Em primeiro lugar, apenas quatro LNS pode ser colhido. Em segundo lugar, a resposta imune deve ser estudada sistémica ou ocorrer nas inguinais superficiais ou braquial (pele de drenagem) LNS. Finalmente, o número de células colhidas é influenciada pela qualidade da remoção LN, uma limitaç...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Pinça Graefe premium Belas Padrão </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-2144 </td><td> Fortemente curvada, 10 cm (4 polegadas), 0,8 milímetros de ponta </td></tr><tr><td> Clipe Michel aplicação e remoção de Pinças </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3779 </td><td> 12,5 cm (5 cm) </td></tr><tr><td> Michel clip 100 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3746 </td><td> 7,5-1,75 milímetros </td></tr><tr><td> Temgesic (cloridrato de buprenorfina) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetalar (cloridrato de ketamina) </td><td> Boniche animal Healthcare </td><td></td><td> DIN: 01989529 </td></tr><tr><td> Rompun (Xylazina) </td><td> Bayer </td> &lt;td&gt; </td><td> DIN: 02169592 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> ABBOTT </td><td></td><td> DIN: 02032384 </td></tr><tr><td> Hypotears pomada </td><td> Novartis Ophtalmics </td><td></td><td> DIN: 02133288 </td></tr><tr><td> Baxedin (clorexidina gluconato 2% em álcool isopropílico a 70%) </td><td> Ómega </td><td> L0000017 </td><td> DIN: 02251477 </td></tr></tbody></table>

murine superficial lymph node surgery

No campo da imunologia, para compreender a progressão de uma resposta imunitária contra uma vacina, uma infecção ou um tumor, a resposta é muitas vezes seguida ao longo do tempo. Do mesmo modo, o estudo da homeostase de linfócitos, requer a realização do curso de tempo. Realização destes estudos, dentro do mesmo rato é ideal para reduzir a variabilidade experimental, bem como o número de ratinhos utilizados. Retirada de sangue permite realização de experimentos do curso de tempo, mas ele só dá informações sobre linfócitos circulantes e fornece um número limitado de células 1-4. Uma vez que os linfócitos circulam pelo corpo e que residem nos gânglios linfáticos têm propriedades diferentes, é importante examinar ambos os locais. A remoção sequencial de nódulos linfáticos por cirurgia proporciona uma oportunidade única para seguir uma resposta imune ou expansão de células imunes no mesmo rato ao longo do tempo. Além disso, esta técnica produz entre 1-2x10 células por 6 nó de linfa que é suficiente para perform caracterização fenotípica e / ou ensaios funcionais. Cirurgia nó de linfa ou seqüencial linfadenectomia foi usada com sucesso por nós e outros 5-11. Aqui, nós descrevemos como os nódulos linfáticos inguinais braquial e pode ser removido através de uma pequena incisão na pele de um rato anestesiado. Desde a cirurgia é superficial e feito rapidamente, o mouse se recupera muito rapidamente, é que cura bem e não sentir dor excessiva. Cada segundo dia, é possível colher um ou dois nódulos linfáticos, permitindo para experiências de curso de tempo. Esta técnica é portanto adequado para estudar as características de nódulo linfático que residem linfócitos ao longo do tempo. Este método é adequado para vários projetos experimentais e acreditamos que muitos laboratórios se beneficiariam de realização de cirurgias seqüenciais nó de linfa.

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Murine Superficial Lymph Node Surgery

Para seguir a progressão de uma resposta imune ao longo do tempo dentro do mesmo rato, gânglios linfáticos pode ser sequencialmente removido por cirurgia. Aqui, nós descrevemos como esta técnica pode ser realizada.

Cirurgia Nó murino superficial linfático

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Imunologia e Infecção

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murino Transplante de pele de espessura total

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...